16个天南星科魔芋属植物叶表皮细胞形态特征及其系统学意义

赵青华，杨朝柱，王 孟，覃 宇，胡永忠，降巧龙，潘娅妮

(1.恩施州农业科学院，湖北 恩施 445000；2.湖北省魔芋种子种苗工程技术中心，湖北 恩施 445000；3.湖北省农业科技创新中心鄂西综合试验站，湖北 恩施 445000)

魔芋为天南星科魔芋属多年生草本植物，起源于古热带，经漫长的地理变迁和隔离形成了多个生态类型[1].全球已知的魔芋属植物超过了200种，集中分布在东南亚、大洋洲和非洲[2-5].我国魔芋属植物约24种，半数以上分布在滇南热带地区，其中6种为中国特有种[6-11].长期的生态隔离和生殖隔离导致魔芋属植物地域交流和基因交流障碍，在种水平上形成的地方居群，其植株大小、叶柄及花柄色泽斑纹、花序构成、球茎形状及肉色等性状表现出高度的多态性，仅从形态学难以准确的进行鉴定和分类，必须借助于其他性状[12-13].国内外在解剖学、孢粉学、细胞学、植物化学、分子生物学等方面做了大量的研究，为魔芋属植物的进化、分类和鉴定提供了丰富的依据[2，12，14-22].

当前，魔芋作为一种具有重要开发前景的膳食纤维源植物，发展速度快，人工大面积种植种类混杂，单纯依靠外观形态鉴定难以获得准确结果，往往导致同种异名和异种同名现象，这对生产不利.叶片是植物与外界环境进行能量、气体和水分交换的关键部位，其形态特征受到基因和环境的控制，是长期适应原生环境的结果[23-26].叶表皮细胞微形态特征尤其是气孔类型在植物分类、系统进化以及原产地鉴别上具有潜在的应用价值[27-33]，而魔芋属植物这方面研究匮乏，仅在少数几个种如南蛇棒(A.dunnii)、白魔芋(A.albus)、花魔芋(A.konjac)、甜魔芋(原文翻译为A.dunnii，应为A.paeoniifolius‘Yellow’)[7]、珠芽魔芋(A.bulbifer)有零星报道而缺乏系统性比较研究，在亚种和变种水平未查阅到相关报道[34-35].因此，对保存于恩施州农业科学院魔芋种质资源圃的16个魔芋属植物叶表皮细胞微形态进行研究，并对13个具有多态性的性状进行系统聚类分析，以期为魔芋属植物的鉴定、演化及分类提供新证据.

1 材料与方法

1.1 材料

16个魔芋种(图1和表1)，其中花魔芋地方种2个(恩施花魔芋，丽江花魔芋)，远缘杂交种1个(鄂魔芋1号).2020年种植于湖北省恩施州农业科研究院高新示范园(alt.=410 m)，遮荫度约50%，常规管理.

1.2 叶表皮细胞观察

叶表皮细胞采用印迹法观察[36].待魔芋完全展叶后，取三裂叶顶部小叶，蒸馏水洗净，滤纸吸干，避开叶眿，用毛刷迅速蘸取少量透明指甲油(BNC，Korean)由内向外涂抹，大小约0.5 cm×1 cm，不可来回或重复涂抹.观察上表皮时涂抹在小叶中部，观察下表皮时从叶尖到基部选取上、中、下三个部位.3～5 min后，用镊子撕下薄膜，置于载玻片上，压平后光学显微镜(浙江舜宇光学)20倍物镜下观察，随机选取5个视野，CCD拍照.

1.3 数据处理

用Image-Pro Plus 6.0计数叶表皮细胞数、气孔数量，测量气孔大小，计算气孔指数(stomata index，SI)和气孔密度(stomata density，SD).SI=Ns/(Ne+Ns)×100%，SD=Ns/A.其中，Ns表示气孔数，Ne表示表皮细胞数，A代表面积(mm2).表皮及气孔的性状参照杨等[37]文献描述.利用SPSS软件对13个具有多态性的性状进行聚类分析，采用平方欧式距离，标准化转换，定性描述赋值，如垂周壁式样1为平直，1.5为平直-弓形，2为弓形，3为浅波，4为深波；上表皮气孔0为无，1为有；气孔分布特点各部位差异不显著为均匀，差异显著为递增或递减.

2 结果与分析

2.1 气孔器性状

16个魔芋种气孔主要分布在下表皮，仅滇魔芋、甜魔芋、优乐魔芋和东亚魔芋上表皮观察到气孔(图1-8a，10a-12a).气孔平列型，由2个副卫细胞和2个保卫细胞组成，副卫细胞表面具条纹，与长轴近垂直，保卫细胞肾形(图1).气孔开口长椭圆形，大小为(24.88～43.62 μm)×(5.80～16.64 μm)，勐海魔芋长轴最小(24.88 μm)，西盟魔芋短轴最小(5.80 μm)，弥勒魔芋气孔最大(43.62 μm×16.64 μm).气孔密度(SD)41.67～159.15个/mm2，鄂魔芋1号最小，西盟魔芋最大.气孔指数(SI)9.47%～19.05%，鄂魔芋1号最小(9.47%)，西盟魔芋最大(19.05%)，弥勒魔芋次之(17.91%)，甜魔芋第三(16.28%).气孔在叶片下表面分布表现不同，9个种从叶尖至基部递增，7个均匀分布(表1).滇魔芋的上表皮和西盟魔芋下表皮均发现了相连气孔器(图2).

a:上表皮；b:下表皮.1：恩施花魔芋(A.konjac cv.Enshi)；2：鄂魔芋1号(F1(花魔芋×白魔芋)(A.konjac×A.albus.cv.emoyu No.1)；3：白魔芋(A.albus)；4：丽江花魔芋(A.konjac cv.Lijiang)；5：A.asterostigmatus；6：西盟魔芋(A.krausei)；7：勐海魔芋(A.kachinensis)；8：优乐魔芋(A.yuloensis)；9：东京魔芋(A.tonkinensis)；10：甜魔芋(A.paeoniifolius ‘Yellow’)；11：滇魔芋(A.yunnanensis)；12：东亚魔芋(A.kiusianus)；13：疣柄魔芋(A.paeoniifolius)；14：弥勒魔芋(A.muelleri)；15：谢君魔芋(A.xiei)；16：珠芽魔芋(A.bulbifer)图1 光学显微镜下16种魔芋叶表皮形状Fig.1 Morphology of epidermis in 16 Amorphophallus species observed by optical microscope

表1 16个魔芋气孔特征Tab.1 Traits of stomata in 16 Amorphophallus species

左图：滇魔芋上表皮气孔.右图：西盟魔芋下表皮气孔.NS：相连气孔图2 滇魔芋与西盟魔芋相连气孔Fig.2 Neighbor joint stomata in upper epidermis of A.yunnanensis and lower epidermis of A.krausei

2.2 表皮细胞特征

16个魔芋上表皮和下表皮垂周壁式样表现出多态性，其中上表皮5种类型，分别为平直、弓形、浅波、深波及复合型平直-弓形，下表皮3种类型，浅波、深波和弓形(表2).表皮细胞形状有多边形和不规则2种类型，勐海魔芋、优乐魔芋、疣柄魔芋上下表皮细胞形状相似，东京魔芋几乎相同(图1-7a，7b，8a，8b，13a，13b)，甜魔芋(图1-10a，10b)、东亚魔芋(图1-12a，12b)、弥勒魔芋(图1-14a，14b)、谢君魔芋(图1-15a，15b)上表皮细胞典型多边形，与下表皮细胞形状差异明显.恩施花魔芋、鄂魔芋1号(F1(花魔芋×白魔芋)、白魔芋、A.asterostigmatus、西盟魔芋、滇魔芋、珠芽魔芋上表皮细胞密布明显的条形纹饰.杂交种鄂魔芋1号垂周壁式样和上表皮形状明显介于恩施花魔芋和白魔芋之间(表2，图1-1a、2a、3a)，与丽江花魔芋差别明显(图1-4a)，可见垂周壁式样和表皮细胞形状受基因控制.

表2 16个魔芋叶表皮细胞特征Tab.2 Traits of leaf epidermis in 16 Amorphophallus species

图3 16个魔芋属植物聚类分析Fig.3 Cluster analysis of 16 Amorphophallus species basing on the polymorphic traits of leaf epidermis

2.3 聚类分析

对魔芋上下表皮细胞垂周壁式样，形状，气孔密度、指数、大小、分布特点等13个具有多态性的性状进行聚类分析.在组间距离17水平上(虚线)，16个种聚类成4个群(图3).

类群I：该群数量最多，包括丽江花魔芋、A.asterostigmatus、勐海魔芋、东京魔芋、恩施花魔芋、鄂魔芋1号、白魔芋、弥勒魔芋、谢君魔芋、疣柄魔芋、珠芽魔芋11个种，气孔密度41.67～95.10个/mm2,气孔指数9.47%～13.09%，均小于其他类群.杂交种鄂魔芋1号与亲本组间距小，弥勒魔芋和谢君魔芋两个珠芽类型魔芋聚类一块，表明聚类可靠性较好.

类群II：包括甜魔芋和东亚魔芋2个种，气孔密度和气孔指数较大，上表皮细胞多边形，垂周壁式样平直，下表皮光滑.

类群III：仅攸乐魔芋1个种，该种裂叶分支处具内生珠芽，上下表皮形状相似，垂周壁式样相同，无条形纹饰，上表皮具气孔.

类群IV：仅西盟魔芋1个种，气孔密度(159.15个/mm2)和气孔指数(19.05%)最大，上表皮垂周壁浅波，下表皮深波，具相连气孔.

3 结论与讨论

人类对魔芋的认知是一个长期、渐进的过程.特别是近30年来，魔芋葡甘露聚糖作为食品级膳食纤维新资源，在全球范围类逐步形成了一个从种植、加工到制品的产业链，日本、中国、中南半岛和马来群岛均有大面积种植.商业开发对魔芋资源产生了深刻的影响，一是打破了魔芋原生地域界限，如原产中南半岛和马来群岛的弥勒魔芋引种至中国云南及广西热带地区，原产与川滇交界的金沙河谷狭小区域的白魔芋在湖北、重庆和贵州均有种植；二是人工定向改良加速了种间基因的交流，创造出新的物种[38]；三是新的魔芋属植物被发掘和鉴定[5-7，11].面对这种复杂的局面，丰富的鉴定手段必不可少.

长期以来，叶片表皮细胞性状表达由基因和环境决定，在属、种水平上的分类、进化和鉴别中受到了广泛的关注[27-33].在本研究中鄂魔芋1号为花魔芋和白魔芋杂交后代，其上表皮垂周壁式样平直-弓形，综合了双亲性状，表明垂周壁更多受遗传控制，可鉴别该性状差异明显的双亲杂交后代.花魔芋两个地方种群丽江花魔芋和恩施花魔芋上表皮出现了明显的分化，前者表皮细胞光滑，垂周壁式样浅波，且叶表面具蜡质，后者表皮细胞密布条纹，垂周壁式样平直，无蜡质，这与生境有关，丽江花魔芋生长在高原，光照和紫外线强烈，需要通过表皮结构改变来反射光线.笔者在考察中发现，丽江花魔芋在云南曲靖、楚雄、保山、丽江，四川攀枝花和甘孜均有分布，因此，可推断花魔芋自云南至少有2条进化路线，一条是朝西北高原发展形成了高原湿润气候生态型，另一条是向东北发展形成了低海拔湿润气候生态型.气孔是叶表皮微形态重要的性状之一，其调控是植物应对环境胁迫有效策略.从气孔类型来看，16个魔芋属植物气孔均为平列型，开口长椭圆形，由2个肾形保卫细胞和2个副卫细胞构成，副卫细胞密布条形纹饰.气孔大小、气孔指数和气孔密度种间变化差异大，这与他人研究结果一致[34-35].西盟魔芋和甜魔芋在云南普洱地区自然分布较多，气孔密度和气孔指数高，与其生长的干热环境有关.叶面具外生珠芽的弥勒魔芋、珠芽魔芋气孔大，二者均为3倍体(2n=39)[12，21].谢君魔芋具有珠芽，分布在云南德宏州一带，俗称红魔芋，对其倍性研究结果存在争议[39-40]，本研究从气孔大小来看支持其为多倍体，但笔者2018年用谢君魔芋作为父本，与二倍体花魔芋(2n=26)杂交获得了实生籽，而用弥勒魔芋花粉与二倍体魔芋杂交至今未获得成功，杂交结果支持其为二倍体.这种结果的原因可能是谢君魔芋是一个混倍性群体.气孔在叶表皮分布于植物的生长习性有关，阳生植物气孔在下表皮，荫生植物上下表皮均有气孔[25].魔芋属半荫生植物，其气孔主要分布在下表皮，但滇魔芋、甜魔芋、优乐魔芋和东亚魔芋上表皮出现少量气孔，可能更耐隐蔽环境.滇魔芋和西盟魔芋中观察到相邻气孔，这与气孔发生不相邻原则矛盾[41-42]，是由于种植环境引起的异常还是种的属性？有待于进一步研究.垂周壁式样的进化顺序为平直、弓形、浅波至深波，弯曲弧度受光照影响[43]，从上表皮细胞垂周壁式样来看，恩施花魔芋、甜魔芋、东亚魔芋、弥勒魔芋、谢君魔芋和珠芽魔芋更原始，勐海魔芋、攸乐魔芋和东京魔芋进化程度高，其余为衍生类型，与Gao Y等[18]利用cpDNA单倍型研究结果较为一致.

16个魔芋分为4个类群，其中甜魔芋和疣柄魔芋分属不同的类群，Yin J等[7]和Gao Y等[18]认为，甜魔芋从疣柄魔芋进化而来的一个栽培种，此外，3个外生珠芽的魔芋(弥勒魔芋、谢君魔芋和珠芽魔芋)形态学非常接近，与叶表皮性状聚类有差异.同时，杂交衍生种鄂魔芋1号与其亲本花魔芋和白魔芋以及谢君魔芋和弥勒魔差距较小，表明叶表皮性状聚类分析在一定程度上能反映进化关系.

由此可见，魔芋叶表皮在气孔密度、大小和气孔指数、气孔分布特点，上下表皮细胞形状、垂周壁式样等性状方面存在差异，这些性状差异更多地受到基因型的决定，反映了物种进化关系和原生环境差异.因此，魔芋属植物叶表皮细胞微形态特征对于在种及以下水平上的分类、鉴定以及进化关系等研究具有一定的参考价值.