玉米自交系对瘤黑粉病抗性鉴定及遗传多样性分析

王铁兵,王 鹏,蒋建军,王 芳

(甘肃农业大学 农学院，甘肃省干旱生境作物学重点实验室，甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室，兰州 730070)

玉米(Zeamays)是具有粮、经、果、饲、能等多种用途的重要农作物之一，就种植面积而言已经是中国第一大作物，其总产的增加对全国粮食增产贡献率位居各大粮食作物之首，可见其增产稳产关系到国计民生。但随着气候变暖、耕作制度改变和单一品种大面积种植，病虫害发生流行严重影响了玉米的稳产[1]。

瘤黑粉病(Ustilagomaydis)是玉米大田生产的病害之一，世界上100多个国家和地区均有发生，它是一种由真菌引起的侵害幼嫩组织的局部性病害，发病极为普遍[2]。有研究表明，在18世纪时人们发现导致植物发病的直接原因为活体真菌玉米黑粉菌[3]。被黑粉菌侵染的玉米组织受其代谢产物刺激而产生大小不一、形状各异的菌瘤，初生菌瘤多为白色或者淡黄色并由表皮组织形成的薄膜所包被，后期所形成的黑粉瘤消耗大量的养分，导致植株空秆不结实，造成严重减产[4-5]。在美国，瘤黑粉病导致玉米每年减产1%至5%，并且流行年份不低于10%；在德国，田间自然发病率1%至3%，1976年发病率甚至超过了50%，使玉米产量损失严重[6-7]。在中国，由于推广的玉米品种中缺少抗瘤黑粉病的品种，加上连年连作，秸秆还田，土壤中黑粉菌的厚垣孢子大量积累，致使玉米瘤黑粉病在东北、华北和黄准海等玉米主产区普遍发生[8]。2000年中国内蒙古曾经发生过该病害，当时田间发病率约20%，部分地块甚至绝收；2012年在东北和华北等玉米主产区，大约有7.2×105hm2玉米感染瘤黑粉病[3,9]。玉米被黑粉菌侵染发病后，一般没有有效的挽救措施，而积极培育和不断挖掘开创抗病品种才是重中之重。种植抗病品种是防治该病害最经济最有效的途径，据报道，国内外很多学者对瘤黑粉病进行了研究与分析，杨克泽等[10]利用药剂对种子进行包衣防瘤黑粉病处理，发现28%灭菌唑和24%噻呋酰胺具有良好的防治效果；姜晓颖等[11]对中国东北地区21个主要玉米自交系进行瘤黑粉病抗性评价，发掘出‘沈139’等9个高抗自交系；严理等[12]对不同用途的22个玉米品种进行瘤黑粉病抗性鉴定，结果发现糯玉米全为抗性，其次是饲用玉米抗性较好，甜玉米抗性最弱；白金铠等[13]研究发现抗瘤黑粉病的自交系较多，杂交种中则较少；Lubberstedt等[14]采用RFLP标记法对玉米进行瘤黑粉病进行QTLs分析，检测到5～10个QTLs；Ding等[15]利用‘综3’和‘87-1’构建的重组自交系发现，抗瘤黑粉病基因与环境互作效应明显。目前，虽然筛选出了一些抗病的种质资源，但是这些种质资源的遗传背景尚未得到进一步分析。SSR具有丰富的多态性、良好的稳定性、操作简单等优点，广泛应用于玉米、水稻、小麦等农作物的种质资源亲缘关系分析，遗传图谱构建等方面的研究[16]。因此，本研究对30份玉米种质资源进行瘤黑粉病的抗性鉴定，并对其遗传背景进行SSR分析，以期筛选出抗瘤黑粉病的育种材料，为玉米抗瘤黑粉病基因发掘与种质改良工作提供基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

‘KYS旱17-9’‘C0343’和‘KYN01’等32份玉米自交系为材料，均由甘肃农业大学平凉玉米育种站自选提供(表1)。

表1 供试玉米自交系名称Table 1 Maize inbred lines

1.2 试验地点与田间设计

试验于2018年在甘肃省定西市安定区凤翔镇进行(E 104°62′，N 35°58′)，该地区光能丰富，雨热同季(主要集中在6、7、8月)，无霜期 140 d左右，年平均日照时数2 500 h，2018年降雨量479 mm，其中6、7月份的降雨量197.9 mm；2019年降雨量(1-11月)477 mm，其中6、7月份的降雨量183.4 mm。前茬为马铃薯。

试验小区采取随机分布，每份材料种植2行，每行留苗25株，重复3次，对照为‘齐319’(高抗)和‘掖478’(高感)，2019年重复鉴定。

1.3 用于鉴定种质遗传资源的SSR引物

引物来源于Maize GDB网站(http://www.maizegdb.org)公布的SSR引物信息情况，选择分布在玉米10条染色上不同bin的69对SSR标记，由上海生工生物工程有限公司合成(表2)。

表2 SSR引物名称与序列Table 2 Name and SSR sequence

(续表2 Continued table 2)

1.4 供试病原菌与田间接种

秋季从病株上以图1-B为标准采集瘤黑粉病菌，阴晾风干后放于纸盒内保存。采用张春民等[17]的注射法接种，使用时将冬孢子充分碾碎，过40目筛后收集均一菌粉，每25 g菌粉加水1 L，充分搅拌后300目筛网过滤，并对滤液加水补足至1 L，备用(现用现配)。

接种时期在玉米植株6叶1心期，用注射器吸取制备好的菌液注射到玉米植株的中下部，每株注入菌液1 mL，见心叶冒液即可，对照组在相同部位注射等量的蒸馏水。

1.5 调查内容及标准

1.5.1 调查内容与抗性等级评价标准 接种第10天和第20天进行田间发病情况调查。调查项目包括：每系总株数、发病株数、发病率(以第20天的调查发病率结果进行抗性等级评价)。玉米瘤黑粉病抗性鉴定依据《玉米抗病虫性鉴定技术规范》(国家行业标准)进行评价[18]，其具体划分为1-9级：1级为高抗(HR)，病株率为0～ 1.0%；3级为抗病(R)，病株率为1.1%～ 10.0%；5级为中抗(MR)，病株率为10.1%～ 20.0%；7级为感(S)，病株率为20.1%～40.0%；9级为高感(HS)，病株率为40.1%～100%。

1.5.2 DNA的提取与PCR扩增 在玉米3叶1心时取玉米叶片贮藏在-80 ℃冰箱中备用，采用CTAB法提取DNA[19]；SSR分子标记的PCR反应体系为：(1)2×TaqPCR Master Mix 5 μL；(2)上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL；(3)模板DNA(50 ng/μL)2 μL；(4)灭菌超纯水2 μL，总体积为10 μL。PCR扩增程序为：(1)95 ℃预变性 5 min；(2)94 ℃变性30 s，50～59 ℃退火30 s， 72 ℃延伸40 s；(3)步骤“(2)”进行35个循环；(4) 72 ℃延伸10 min。用8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增后的PCR产物进行检测，检测结果如图2所示。

图1 玉米瘤黑粉典型照片Fig.1 Typical photo of Ustilago maydis

图2 SSR引物umc1555和nc130凝胶电泳图Fig.2 Gel electrophoresis of SSR primers umc1555 and nc130

2 结果与分析

2.1 不同玉米品种的发病率情况

由表3可知，对6叶1心期的玉米幼苗在接种黑粉菌后的第10天，都表现出瘤黑粉病的症状。30份材料的发病率情况不同，发病率为 3.33%～53.33%， ‘锋967-2硬长’的发病率最低，为3.33%；‘XZX674-2半’发病率最高，为 53.33%。在接种后的第20天，所有材料都发病，并进入发病增速期，发病率为10.00%～ 86.67%，‘锋967-2硬长’的发病率最低，为 10.00%，‘10玉1172-1’发病率最高，达86.67%。在接种后的第20天，发病率≥50%的有13份材料，占供试材料的40.63%，此后发病率没有增长。

表3 不同玉米材料发病率情况Table 3 Incidence of different maize varieties

2.2 不同玉米品种的发病株率与抗性等级

在接种后的第20天，通过30份玉米种质资源对瘤黑粉的田间抗性鉴定发现，不同玉米种质对玉米瘤黑粉病具有不同程度的抗性(表4)，其中‘锋967-2硬长’表现为抗瘤黑粉病，占供试 材料的3.33%； ‘XZX5221-1’‘Q6196-6-1-1’‘10ZX-1418张’‘FN296-2’‘FN119-5’和‘10玉39’表现为中抗瘤黑粉病，占20.00%；‘KYN01’‘Q529-1-2长’‘XFN无名13-3’‘Q6193-3-14’‘FN95-1马’‘FN25-2硬’‘Q6193-3-1-2’‘Q416-1-21’和‘10HN17’表现为感瘤黑粉病，占 23.33%；‘KYS旱17-9’‘C0343’‘FN张’‘XZX513’‘10ZX123’‘10H101445’‘10玉1172-1’‘FNA30-1半’‘Q518-22S’‘26193-3-1-2’‘10ZX869-11’‘1048-2硬长’‘XZX674-2半’和‘10HN1383-11硬’表现为高感瘤黑粉病，占 46.67%。其中，‘锋967-2硬长’的抗性最高，‘10玉1172-1’的抗性最弱。

表4 不同品系玉米的发病株率与抗性等级Table 4 Incidence and resistance levels of different strains of maize

2.3 SSR分子标记的多态性

筛选出具有多态性且扩增条带良好的69对SSR引物，对32份玉米种质资源扩增结果进行统计分析(表5)。共检测到272个等位基因，等位变异幅度为3～6，平均每个标记3.64个，引物phi109275和umc1555检测到的变异最多为6个，引物phi227562、phi046和phi072等检测到的变异位点最少为3个。多态性信息量为0.435～0.846，平均0.764，其中引物 umc1196最大，为0.846；引物umc1545最小，为0.245。

表5 69对SSR引物多样性统计Table 5 Diversity statistics of 69 SSR markers

2.4 聚类分析

由图3可知，对30份玉米种质资源与‘齐319’和‘掖478’进行遗传聚类分析可知，32份种质资源的遗传相似系数为0.615～1.000。当遗传相似系数为0.643时，将32份玉米种质资源分为 4类，第Ⅰ类19份材料，其中包括1份高抗材料‘齐319’，1份抗病材料‘锋967-2硬长’‘XZX5221-1’‘Q6196-6-1-1’和‘10ZX-1418张’等6份中抗材料；第Ⅱ类有7份材料，其中有6份感病材料和1份高感病材料‘掖478’；第Ⅲ类和第Ⅳ类各含有3份材料，均为高感材料。

3 讨论与结论

育种材料的抗病性鉴定，对育种效率的提高和种质资源的利用具有重要意义，因此国内外的玉米育种专家十分重视种质资源的收集，不断挖掘新的抗病材料，以满足玉米抗瘤黑粉病育种的需求，从而为培育出更有针对性的新品种，防止病害的广泛流行奠定基础[21]。本研究采用多年的鉴定方法，所鉴定出的抗性种质对应用于育种生产有更高价值。研究筛选鉴定出7份抗瘤黑粉病的种质材料，其中‘锋967-2硬长’的抗性最好，达到抗病水平；鉴定得到的7份抗性材料可为抗病基因定位、克隆等更进一步的研究提供基础材料，并为抗瘤黑粉病品种的培育提供可选择抗源，从而拓宽抗瘤黑粉病种质资源的遗传背景。例如可以配制‘锋967-2硬长’ב10玉1172-1’的杂交组合，利用杂种优势选育出抗病品种，且随着抗性的进一步稳定与提高，可以作为一个比较好的抗瘤黑粉病的品种。此次鉴定表明，感病材料所占比例明显高于抗病材料，这与严理等[12]对玉米品种对瘤黑粉病抗性的鉴定结果一致。要得到高抗种质，除大范围收集与筛选高抗种质外，还可通过种质创新或改良，解决现有种质资源中抗病种质匮乏的限制，打破抗源单一遗传背景的现状，以实现对玉米瘤黑粉病的有效控制。目前，中国玉米种质资源虽然丰富，但没有发现对瘤黑粉病完全免疫的材料。因此发掘新的抗瘤黑粉病的种质材料，并对这些种质材料的抗病性等进行明确划分显得尤为重要[19]。

种质资源亲缘关系的研究是种质资源利用的必要前提，丰富的遗传资源是玉米育种的基础，确定种质资源的遗传多样性程度和亲缘关系远近是育种的关键，遗传的同源性越低，遗传基础越宽，对杂交育种越有利，使玉米育种材料选育和推广更有针对性。SSR标记具有信息量丰富、稳定性好等优点，已成为遗传育种和资源分类研究中应用最广泛的分子标记[22-24]，这对指导合理划分优势群体，建立相应的杂交育种模式，提高玉米抗瘤黑粉病育种效率具有重要意义。张思奇等[25]对59份玉米种质进行穗腐菌的抗性评价，并利用6对SSR将59份玉米种质划分为8个组群，第1类群体中含有的4份种质，均为抗病；陈永坤等[26]对64份玉米自交系进行粗缩病的抗性鉴定，采用70对SSR引物对64份玉米自交系进行聚类分析，将供试自交系划分为 6个群体，其中第1和第4类群中含有的抗病自交系较多；王艳梅等[27]对中国40份玉米自交系进行丝黑穗病的抗性鉴定，采用57对SSR引物对40份自交系进行聚类分析，将40份自交系分为5类，抗病材料主要集中在第5类群。对于玉米瘤黑粉病抗性鉴定的种质进行聚类分析的研究未见相关报道，本试验利用69对 SSR引物对2个标准测验种和30份材料进行聚类分析，将32份玉米种质资源在遗传相似系数为0.643时分为 4类，说明这些材料有比较丰富的遗传变异，对抗病育种的选择和利用提供有效的参考信息。但抗瘤黑粉病的种质材料全部集中在第Ⅰ类，这些抗性材料遗传基础狭窄，距离差异小。这主要是因为品种选育过程中所用亲本使用过度，育种材料的遗传差异很小，亲缘关系较近，导致了大田生产中所用的抗瘤黑粉病品种的遗传背景狭窄[16]，对环境的适应力和对病害的抵抗力下降。所以在抗病育种过程中，要深入挖掘种质资源的亲缘关系，减少使用亲缘关系较近的材料作为亲本，应该利用不同遗传背景的材料作为亲本，以增强品种对环境的适应能力，提高其对病害的抵抗力。

利用SSR分子标记研究玉米种质资源的遗传多样性，可对育种方法提供参考信息，为提高育种历程提供可靠的分子依据。胡德分等[28]采用61对SSR引物在84份玉米材料中扩增出622个等位基因位点，平均每对引物检测到的等位基因位点为10.23个，多态性信息含量平均为0.779；陈波[29]以30份特异玉米地方品种和 2份玉米骨干自交系为材料，用83对SSR引物共检测出475个等位基因，平均每对引物检测到的等位基因位点为10.1个，多态性信息含量平均为 0.626；赵旭等[30]用70对SSR引物在96份玉米材料和6个国内通用的标准测验种中扩增出213个等位基因位点，平均每对引物检测到的等位基因位点为3.610个，多态性信息含量平均为0.670。本试验采用69对SSR引物对32份种质资源进行扩增，一共分析筛选出272个等位基因，平均每个标记3.64个，多态性信息量为0.435～0.846，平均 0.764，相比以上研究，本研究所检测到的多态性信息量较为丰富，表明本试验所用的种质材料遗传多样性较高，可为抗瘤黑粉病的品种选育等研究提供参考。