髓石的理化特性研究

2020-12-04郜珍燕郑舒宁聂敏

实用口腔医学杂志 2020年6期

郜珍燕郑舒宁聂敏

生物体内的钙磷等无机离子在生物大分子的调控作用下，形成机体矿化组织的过程称为生物矿化，形成生物矿化的无机材料广泛存在于自然界中[1]。生物矿化有生理性和病理性两种。生理性矿化指机体生长发育阶段，无机离子和有机质结合形成的矿化组织，如骨骼，牙体组织等。而病理性矿化指机体对生物矿化的调节作用失衡，无机离子异位矿化或形成异常矿化，如髓石，肾结石，胆结石等等。

牙体组织的生理性矿化，如牙本质的矿化，是钙磷等无机离子与成牙本质细胞分泌的胶原蛋白、磷蛋白等有机质结合，最终形成牙本质，如前期牙本质、罩牙本质等等。因秞质表面磨损、龋坏等遭受破坏，形成的反应性牙本质和修复性牙本质也属于生理性矿化。

牙体硬组织的病理性矿化，如牙髓钙化，是当牙髓组织由于营养不良或组织变性时，钙盐可沉积，并形成大小不等的不规则钙化团块[2]。牙髓钙化的分类，最早是由Moss-Salentijn[3]在1988 年提出来的，他将牙髓钙化按发生机理分为髓石(pulp stone)、小牙(denticle)和弥散型钙化；根据组织学结构分为管状牙本质、规则钙化物和不规则钙化物。

牙髓钙化的发生率根据检测手段、纳入标准的不同，可有很大的差异。各类文献报道的牙髓钙化的发生率从4%～78%[5-7]。在全口牙中，至少有50%[8]的牙齿存在牙髓钙化的现象。很多文献认为年龄是牙髓钙化的主要因素，也有学者认为牙髓钙化与年龄无关。另外龋坏、外伤、治疗史，外伤史等都可使牙髓钙化的发生率提高。

髓石是牙髓钙化的一种，主要是由于牙髓细胞的原发性钙化产生。胶原纤维、基质及坏死细胞代谢产物形成髓石中心，随后板层状或放射状的钙化沉积，形成髓石。上皮-间叶组织的相互作用也可引起牙髓钙化，如残余的Hertwig上皮根鞘可诱导邻近的间质细胞分化为成牙本质细胞，继而逐步形成牙髓钙化，这种钙化结构一般是中空的。

另外在某些因素的影响下，局部碱性磷酸酶活性升高，钙、磷离子代谢障碍，可形成钙盐沉积，并与变性的组织、异物一起形成牙髓钙化。这种称为营养不良性钙化，常见的因素有创伤、先天性因素、感染等。

髓石的形态有很多，或大或小，一般游离存在于髓腔内，或附着于牙本质壁上。形态较大的髓石容易获得，所以很多文献研究的牙髓钙化团块其实就是髓石。

本文应用多种物理方法研究髓石的理化性质，如髓石的元素组成及比例，晶体结构和形态等，并与健康牙本质进行比较，为了解其产生机理提供理论支持。并且，本文将髓石与肾结石等等进行对比，了解它们之间的异同，探讨机体钙化产生的原因，以找到预防牙髓钙化的方法。

1 材料与方法

1.1 样本收集

健康牙本质来源于武汉大学口腔颌面外科正畸拔除的前磨牙，牙体组织完整，无龋坏组织；髓石来源于武汉大学牙体牙髓科根管治疗过程中从髓腔中取得的髓石；肾结石是由武汉大学中南医院泌尿外科手术中取得。

收集髓石样本66 个，其中男性30 例，女性36 例，年龄阶段为20～65 岁；牙本质样本4 个，其中男性2 例，女性2 例，年龄阶段为18～25 岁；肾结石样本5 个，其中男性3 例，女性2 例，年龄阶段为40～70 岁。

1.2 样本准备

样本收集后彻底清洗干净，去除污染物。所有样本用pH为7.4的PBS溶液漂洗，然后用不同浓度的酒精进行脱水(75% 2 d、 90% 2 d、 100% 2 d)。

1.3 立体显微镜观察

立体显微镜可观察物体的立体形状、颜色及表面微细结构,并能进行显微解剖操作,也可以观察生物机体的组织切片等，它可以呈现三维影像，具有操作方便、直观等优点。观察样本的微细结构是在口腔医学教育部重点实验室(武汉大学)进行的，应用的仪器是Zeiss Stemi SV 11 Apo立体显微镜(蔡司公司，德国)。其放大倍数为：×1.8～×412.5，连续变倍6.25∶1。

1.4 X射线成像观察

X射线成像可以了解生物材料、复合材料、晶体等的内部结构，研究晶体缺陷形成机制等等。X射线成像是在中国科学院高能物理研究所4W1AX射线成像实验站进行的。其纳米三维成像的能量范围是5～12 keV，光通量>1×108@8 keV，空间分辨率50～100 nm，光斑尺寸(H×V)15 μm。纳米分辨三维成像显微镜的CCD探测器(Photonic Scinence公司，英国)配合精密样品转台拍摄样品不同角度的放大投影像，利用CT重建算法，获得样品的三维密度分布。

1.5 X射线荧光分析

X射线荧光分析(XRF)是一种快速、非破坏式的用于确定材料元素组分的测量方法，它对材料的要求比较低，固体、粉末、液体等都可进行分析。这种分析方法不仅可以了解材料的元素信息，还可以了解元素的含量信息。实验中进行的X射线荧光分析是在中国科学院高能物理研究所4W1B荧光站进行的。其能量范围是8～15 keV，光通量>1×108@15 keV，光斑尺寸(H×V)10 μm， XRF检测限几十ppm。结果运用PyMca软件和Origin软件进行分析。

1.6 X射线衍射分析(XRD)

XRD是分析材料的衍射图谱，获得材料的成分、材料内部原子或分子的结构或形态等信息的研究手段。本实验是在中国科学院高能物理研究所的4B9A衍射实验站进行。其能量范围是4～15 keV，能量分辨率为(ΔE/E)3×10-4，光通量>1×1010@8 keV，光斑尺寸(H×V)2×1 mm2，角分辨率 0.9 角/s。

2 结果

2.1 立体显微镜影像

在图 1A～1B中，分别是将髓石放大2.5 倍及10 倍，观察其表面结构，可以看到髓石是“晶莹剔透”的晶体结构，表面均匀，均质。将牙本质结构放大10 倍(图 1C)，可以看到其表面也是均质的，并且有牙本质小管的结构(红色方框中)。在图 1D～1E中，将肾结石放大2.5 倍及10 倍，可以看到肾结石也是“晶莹剔透”的晶体结构，但其表面是颗粒状的晶体。

2.2 X射线成像结果

分别将髓石及肾结石的样本进行了断层扫描(图 2A～2C)和3D 重建(图 2B, 2D)，结果中可以看出髓石是一种均质的实体，内部结构均匀。而肾结石是很多颗粒状晶体的聚合体，每个晶体是结构均一的实体。

2.3 X射线荧光分析结果

根据4W1B荧光站通道-能量标记周期表的结果，用PyMca软件处理结果，获得了荧光分析图谱(图 3)，用Origin软件进行了元素定量分析，获得了不同样本元素含量的平均值(表 1)。

通过对比发现：在髓石中，含量较高的元素是Ca、Zn、Cu、As、P、Pb等；牙本质中含量较多的元素有Ca、P、Na、Mg、Cu、Fe、Zn等；肾结石中含量较多的元素有Ca、P、Si、Cu、Hg、Fe、Pb，Zn等。

图 1 立体显微镜影像

图 2 X射线成像

图 3 髓石、肾结石、牙本质的光谱

为了更好地看出髓石、牙本质及肾结石中的元素含量，做出了各种样本的元素百分比图(表 1)。

2.4 X射线衍射分析结果(图 4)

髓石的晶体结构主要是钙磷酸盐晶体。表明牙本质的晶体结构主要是钙磷酸盐晶体。可以看出肾结石的晶体结构主要有几种晶体结构的混合体。

3 讨论

牙髓和牙本质在胚胎发生和结构功能方面关系密切，称之为牙髓-牙本质复合体[9]。成牙本质细胞分化合成牙本质的有机基质，再通过磷灰石晶体的球形矿化最终形成牙本质。随着牙本质不断形成，成牙本质细胞向中心移动，同牙髓腔内的含多血管的结缔组织一起称为牙髓。成牙本质细胞是牙髓中的主要细胞成分，其突起深入牙本质小管中。

表 1 髓石、肾结石、牙本质的元素含量对比

图 4 X射线衍射分析结果

通常认为髓石的产生跟牙髓细胞(主要是成牙本质细胞)的变性钙化有关。因此我们推断髓石与牙本质有相似的结构。我们的研究(图 1～2)发现，髓石是均质的实体结构，没有牙本质中的牙本质小管结构。髓石和肾结石都可能跟营养不良性钙化有关，我们推测髓石与肾结石也有相关性。在立体显微镜和X射线成像(图 1～2)的结果看，髓石和肾结石都是均质的晶体，但肾结石是多种晶体的混合体。

从X射线荧光分析结果中，可以发现髓石和牙本质的元素组成相似(图 3)，都含有大量的Ca、P元素，还有Cu、Zn等元素。但髓石中Cu、Zn元素的比例较高。Berès等[10]将Ca作为参考元素，对比了髓石、龋坏牙本质和健康牙本质，发现髓石和龋坏牙本质中Cu/Ca及Zn/Ca的比值大于健康牙本质。

髓石与肾结石的比较可见二者也有相似元素组成，并且在肾结石中也含有较高比例的Cu、Zn元素。

研究表明Cu和Zn元素是生物体必需的微量元素，参与多种代谢过程，Ren等[11]通过多种表征方法发现，在磷灰石晶体中Zn可以替代Ca在晶格中的位置(不超过5%的含量)，而不改变晶格的参数。并且，这种整合Zn元素的磷灰石晶体可存在于多种生理或病理性矿化过程中[12-13]。一些研究已了解到Zn和Cu在骨和牙齿中可与金属酶结合[14-15]。Berès认为Zn和Cu元素可能跟炎症反应中的Cu/Zn 过氧化物歧化酶(SOD)有关。

本实验结果中发现髓石中Zn和Cu的含量增加，这提示我们髓石的形成跟牙髓细胞的炎症反应有关。肾结石中Zn和Cu的含量增加也可能跟Cu/Zn 过氧化物歧化酶(SOD)有关。

从图4的衍射结果看，髓石和牙本质有相似的晶体组成结构，即磷灰石晶体。髓石的晶体结构与牙本质和骨组织相似。肾结石是多种晶体结构组成的混合体，这与先前文献报道的肾结石的结果一致。

研究牙髓钙化有重要的临床意义，不仅针对口腔方面，更有助于一些全身性疾病的诊断。牙髓钙化通常无症状，有时会引起牙痛，会影响根管治疗的成功率。赵源庆等[16]报道两例髓石引起三叉神经样疼痛的病例。Nãsström等[17]通过研究表明髓室狭窄和髓室内钙化的患者终末期肾病的发生率增高。另外，Edds等[18]对有牙髓钙化的患者做了问卷调查，结果显示74%的患者有心血管疾病史，显示心血管疾病和髓石有相关性，髓石的检查可作为早期心血管疾病的筛查。