MicroRNA调控肝细胞癌EMT 和细胞外基质重塑的研究进展

周 昊，封 冰综述，王 锐审校

0 引 言

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是全球最常见的恶性肿瘤之一，并已成为肿瘤相关死亡的第三大原因[1]。早期肝细胞癌可以通过手术治愈。但是，由于早期症状不典型和缺乏合适的诊断工具，大多数患者确诊时已经处于Ⅲ期，伴有远处转移，不再适合手术，只能通过靶向治疗或者介入治疗延长生存时间。若能够早期发现转移灶，并通过分子靶点有效抑制HCC的转移，对于提高患者生存率及改善预后具有重要意义。本文主要就MicroRNAs(miRNAs)通过Wnt(Wingless/Int1)及转化生长因子β(transforming growth factor β, TGF-β)通路影响肝癌细胞上皮-间质转换(epithelial-mesenchymal transition，EMT)及细胞外基质重塑的研究进展作一综述。

1 HCC转移机制

HCC转移涉及五个经典步骤，包括邻近组织的局部侵入，血管内渗透，循环系统中的存活，外渗，以及肝(肝内)或远端器官(肝外)的异常定植。很多时候，肿瘤迁移和侵袭与EMT紧密相关。EMT 的特点是细胞表面上皮表型减少和间质表型增多，细胞骨架重构、间叶细胞的表型增加、细胞-细胞间或细胞-基质间的黏附性减弱、细胞的移动能力增强等改变，肿瘤细胞从极性上皮样细胞转变为间充质表型细胞[2]。通过EMT，肿瘤细胞的细胞间黏附降低、运动能力增加，获得从原位向周围侵袭的能力，最终进入血液和淋巴途径转移到远处形成新的病灶。这一过程与多种生长因子(EGF、FGF、TGF-β等)和转录因子有关，包括 Snail(Snail/Slug)家族，ZEB(ZEB1/ZEB2)家族和HLH家族(Twist1)等[3-5]。这些转录因子作用于E-cadherin启动子，抑制其转录。 E-cadherin的表达缺失，能进一步激活间质细胞相关基因，如波形蛋白和N型钙黏蛋白的转录及表达，从而引起细胞形态的改变，促进了肿瘤细胞的运动能力和侵袭能力[6]。此外，肿瘤细胞周围的微环境发生变化，也是肿瘤发生转移的重要原因之一。

2 MiRNA与HCC转移

miRNAs是一组高度保守的小型非编码RNA，由20～22个核苷酸组成，负责基因的转录后调控。成熟的miRNA进入 RNA 诱导的沉默复合体中，单链 miRNA在输入蛋白 XPO8的介导下与靶mRNA分子结合，随后mRNA在复合体中的核酸内切酶argonaute的作用下被分解。在动物细胞内，miRNA与靶mRNA的结合位点不完全互补，miRNA通过靶向结合mRNAs的3′UTR，少部分则靶向mRNA的5′UTR，导致mRNA翻译抑制，从而调节转录后基因表达[7]。因此，miRNA通过靶向多种基因参与调节各种生物活性。越来越多的研究表明，miRNA的失调与各种癌症的发展和进展相关，并作为癌基因或肿瘤抑制因子发挥作用。失调的miRNA被认为是癌症临床诊断和预后的有用生物标志物，也是癌症治疗的潜在治疗靶点[8]。然而，miRNA调节网络在HCC发生、发展中的机制细节仍然很大程度上未知。近来研究发现，miRNA通过调节多种信号通路参与了肿瘤细胞的转移过程，如Wnt、TGF-β信号通路等，同时微环境在HCC转移中也起到重要作用。

2.1 Wnt /β-catenin信号通路与HCC转移在正常成熟细胞中，Wnt通路处于关闭状态。β-连环蛋白(β-catenin)是细胞表面钙黏蛋白复合物的一种成分，胞浆中的β-catenin大部分与突出于细胞膜的E-cadherin结合，形成β-catenin/E-cadherin复合体，再与肌动蛋白骨架相连，介导细胞间黏附，调节肿瘤细胞的侵袭和转移能力[9]。目前发现Wnt信号途径激活有三条途径：Wnt/Ca2+途径、平面细胞极性途径和正规Wnt途径。当Wnt基因在肿瘤中被异常激活，其蛋白与胞膜卷曲蛋白(frizzled, Fz)受体结合，激活松散蛋白(dishevelled, Dsh)，进而抑制GSK3β/APC/Axin复合物对β-catenin的磷酸化，降低了β-catenin的磷酸化降解，胞质中聚集增多的β-catenin转进入细胞核，与核内转录因子T淋巴细胞因子(T-cell-specific transcription factor, TCF)/淋巴样增强因子发生作用，激活下游众多靶基因如c-MYC和cyclin D1的过度表达, 从而诱导HCC的EMT过程[10-11]。

许多miRNA可直接与Wnt信号通路中的细胞因子相互作用。如miR-766-3p可与Wnt3a的mRNA结合，下调Wnt3a的表达，从而通过Wnt/PRC1正向调节环抑制HCC细胞的侵袭和迁移[12]。在HCC中，高表达的Wnt3a往往与预后不良相关。miR-504、miR-542-3p、miR-485-5p可与Frizzled 7(FZD7)的mRNA的3′-UTR区域结合，负向调控其表达，从而抑制HCC细胞中β-catenin的核转位，阻止细胞核中β-catenin的积累和Wnt信号的激活[13-16]。Frizzled 5(FZD5)也是Wnt的共同受体，miR-1324直接靶向FZD5 mRNA，抑制HCC中Wnt/β-catenin信号通路的激活[17]。GSK3β是Wnt /β-catenin信号通路的重要成员，可以通过在Ser33，Ser37和Thr41处磷酸化使β-catenin降解。生物信息学分析预测GSK3β上存在miR-1246、miR-26a-5p的潜在结合位点。体外实验证实这两个miRNA可以直接与GSK3β mRNA结合，抑制其转录后翻译，从而促进β-catentin通路的激活。临床数据也验证了在肝癌组织中miR-1246、miR-26a-5p表达明显上升，与肿瘤临床分期及预后呈负相关[18-19]。

除直接影响通路中的细胞因子外，miRNA还可作用于一些与Wnt/β-catenin信号通路存在相互作用的细胞因子。分泌的分泌性卷曲相关蛋白(secreted frizzled- related protein, SFRP)是一种可溶性的分泌性糖蛋白, 位于染色体8p12-11.1，可与卷曲受体竞争Wnt蛋白[20]。miR-27a与SFRP1的mRNA 结合，在转录后水平抑制其表达。SFRP1的表达降低会导致更多的Wnt蛋白与Fz受体结合，进而促进EMT发生[21]。FOXO3a是Forkhead box O(FOXO)转录因子家族的成员，可与β-catenin结合，是一种肿瘤抑制基因。FOXO3a与TCF竞争β-catenin，减少β-catenin/TCF复合物的形成，抑制Wnt /β-catenin通路的下游信号传导。miR-182-5p与FOXO3a mRNA的72-79位点存在互补序列，在转录后水平抑制FOXO3a表达，进而增强β-catenin与TCF4之间的相互作用，促进Wnt/β-catenin通路的激活。此外，β-catenin的表达增多会反过来促进miR-96，miR-182和miR-183的转录，形成Wnt /β-catenin-miRNA正反馈环，进一步诱导肝细胞癌发生和进展[22]。

有的miRNA会同时对两种及以上的细胞因子产生影响。miR-500a可直接结合SFRP2和GSK-3βmRNA的3′-UTR，同时增强Wnt蛋白与卷曲受体的结合并减少β-catenin的降解，增加Wnt通路下游靶点的激活[23]。有的miRNA还可同时影响多个信号通路。HMGA2是一种高迁移率A族蛋白质的膜，是一种非组蛋白染色质结合蛋白，参与调节各种类型癌症发生和进展。与正常组织相比，HMGA2在各种类型的肿瘤组织中都表达增加，在肝细胞癌中也是如此。miR-337可通过结合HMGA2来抑制PI3K/AKT和Wnt/β-catenin信号通路的激活，发挥抑癌基因的作用[24]。

2.2 TGF-β通路TGF-β是转化生长因子的一个重要亚类，其家族庞大，包括9个亚族，共27类因子，参与调节胚胎发育过程中的EMT现象。其机制主要是通过Smad依赖通路和非Smad依赖通路完成的。Smad蛋白存在于胞质中，是由Smad基因编码的相对分子质量为42 000～60 000 Da 的蛋白质分子。作为TGF-β受体复合物的下游信号调节蛋白, Smads蛋白家族可将信号由胞膜传导至胞核, 从而调控基因转录。典型的Smad依赖通路诱导的EMT过程如下: TGF-β首先与肿瘤细胞膜上的TGF-βⅡ 型受体(TpRⅡ)结合, 通过TpRⅡ激酶使TGF-βⅠ型受体(TpRⅠ)磷酸化后激活下游的Smad2/3, 磷酸化的Smad2/3再与胞内的Smad4结合形成三聚体, 进入细胞核, 并与DNA结合而发生相互作用, 促使EMT形成。而非Smad依赖通路中，活性TGF-β受体则激活PI3K/AKT，ERK，JNK/p38和RhoA等信号通路，诱导其下游转录。异常的TGF-β表达是肿瘤发展的罪魁祸首之一。最初，是抑制细胞生长并诱导细胞凋亡的肿瘤抑制因子。然而，在肿瘤进展的后期阶段，TGF-β充当肿瘤启动子，与肿瘤侵袭性的增强和远处转移相关[25]。

根据miRNA靶基因的多样性，靶标预测表明TGF-β信号传导途径中的许多个组分都被miRNA靶向。通过实验，已经证实多种miRNA通过靶向配体、受体、Smad蛋白和非Smad依赖通路中的组分调节TGF-β信号通路的激活。miR-142、miR-542-3p可通过直接靶向TGF-β1的3′UTR，抑制TGF-β1的翻译，从而抑制TGF-β信号通路的激活。在HCC中，miR-542-3p的表达减少、而miR-142发生甲基化，进一步诱发肿瘤的进展[26]。许多miRNA与TGF-β受体结合，特别是TGF-βⅡ型受体(TpRⅡ)，如miR-302d、miR-590-5p等。这些miRNA与TpRⅡ受体mRNA结合，抑制其翻译，从而抑制TGF-β通路下游因子的激活，从而抑制HCC细胞的EMT过程[27-28]。

2.3 Smad依赖通路SMAD蛋白是Smad依赖通路中的关键节点，许多miRNA均靶向SMAD蛋白，miR-142就是其中之一。可与SMAD3的mRNA结合，从而抑制TGF-β的激活。经过研究发现，在HCC的发展过程中，miR-142在HCC细胞中过度甲基化，导致其表达显著减少，促进肿瘤的转移[29]。而miR-125b则可抑制SMAD2及SMAD4的翻译，从而削弱EMT和相关性状[30]。

Fos相关抗原2(FOSL2/FRA2)与FOS异二聚体和Jun同源二聚体一起构成AP-1转录因子家族。FOSL2促进侵袭性肿瘤生长，在TGF-β信号通路的调节中起重要作用，在HCC中Fos水平明显升高。miR-133a通过靶向FOSL2影响Smad3蛋白的表达，从而抑制HCC的转移[31]。

miR-145通过HCC中Smad3的特定结构域特异性磷酸化，产生pSmad3C从而抑制肿瘤进展。而miR-21通过ERK1/2/MAPK促进肿瘤的增殖和转移。反之，pSmad3C的增加又导致miR-145表达上调及miR-21下调，从而进一步抑制肿瘤进展[32]。

2.4 非Smad依赖通路TGF-β信号通路的下游转录因子同时调节许多miRNA的转录，如miR-200家族、miR-203和miR-216/217等。TGF-β信号通路下游的转录因子ZEB家族等均可抑制其转录。TGF-β信号通路和miRNA途径相互影响，形成反馈调节环。ZEB家族包括ZEB1，ZEB2，Snail1和Slug，在调节生理和病理性EMT中发挥核心作用。在EMT过程中，ZEB1不仅可与E-钙黏蛋白启动子的E-box元件结合来抑制E-钙黏蛋白转录，还可激活间充质基因。

MiR-200家族是最经典的调控EMT的miRNA家族。其包含五个miRNA：miR-200b、miR-200c、miR-429、miR-200a、miR-141。分别由miR-200b/200a/429和miR-200c/141两个簇转录，这两个簇的启动子区域存在ZEB型E-box元件，当发生EMT时被TGF-β诱导的转录抑制因子ZEB1和ZEB2抑制。相反，miR-200家族靶向ZEB1/2的3′-UTR。因此，ZEB1/2和miR-200家族形成双向负反馈环。此外，miR-200家族还通过调节Rho-ROCK信号传导、黏着斑、基质金属蛋白酶等EMT的关键转录因子来维持上皮特性并防止转移。另外，miR-205、miR-101也存在类似的机制[33]。

在HCC中，miR-630作为肿瘤抑制因子靶向Slug抑制HCC的转移。在miR-630转录起始位点上游的1.0-kb区域存在SP1和c-Jun的响应元件。TGF-β通过Erk/SP1和JNK/c-Jun信号通路抑制miR-630转录，从而间接上调Slug，促进HCC细胞运动和侵袭。除调节信号传导，部分miRNA可直接影响钙黏蛋白的翻译。miR-199b-5p、miR-194可直接靶向N-钙粘蛋白的3′-UTR端，从而显着抑制HCC细胞中N-钙黏蛋白的表达，抑制HCC细胞的转移。此外miR-199b-5p还可抑制TGF-β1激活的Akt磷酸化，TGF-β1通过Akt磷酸化诱导N-钙黏蛋白过度表达。同时TGF-β1还通过非Smad信号传导途径miR-199b-5p下调，形成了一个调节环[34-35]。

miR-34/miR-449家族由6个同源成员组成：miR-34a，miR-34b，miR-34c，miR-449a，miR-449b和miR-449c。miR-449a，miR-449b和miR-449c均由CDC20B的第二个内含子中基因簇编码，由组蛋白乙酰化共同调节，以细胞系依赖性方式调节SOX4。转录因子SOX4的生理功能是调节胚胎发育过程中的发育过程，如调节纤毛发生和胆管形成。临床研究发现，HCC标本中SOX4是表达明显上升。而SOX4转录因子受TGF-β下游的Smad2和Smad3直接调控，SOX4过表达是TGF-β介导的上皮-间质转化和细胞迁移的关键因素。miR-449家族通过阻止TGF-β介导的SOX4过表达来干扰TGF-β途径，从而抑制细胞迁移[36]。

2.5 微环境与HCC转移已有研究发现肿瘤微环境对于多种癌症的转移是至关重要的。虽然之前的研究主要集中在miRNA对癌细胞内在特性的影响，但最近的报道显示，miRNA也可影响癌细胞与其相关基质之间的相互作用。

在癌症的早期阶段，上皮样癌细胞分泌各种生长因子活化成纤维细胞、降低MMPs表达，使癌细胞外基质(extracellular matrix，ECM)降解减缓，细胞基质硬度增加。活化的成纤维细胞还能通过调控胰岛素样生长因子、角化细胞生长因子等促进肿瘤细胞生长、抑制凋亡。之后，成纤维细胞表现出肌成纤维细胞的特征，激活TGF-β通路等促进细胞发生EMT，并产生FGF-2等因子促进血管生成。此外，CAF还上调赖氨酰氧化酶(lysyl oxidase，LOX)表达、分泌胶原蛋白Ⅰ，Ⅱ，Ⅴ，Ⅸ形成胶原纤维，进一步重塑和增强ECM。由于过度的增殖和生长，肿瘤核心区域开始缺氧，癌细胞分泌血管内皮生长因子和结缔组织生长因子增加，增强血管生成并向周围浸润。当癌细胞发生EMT时，会产生CSF-1，吸引巨噬细胞至肿瘤部位，产生EGF，IL-33等进一步促进转移。在肿瘤边缘，基质细胞还会排列成胶原束，肿瘤细胞经此向周围转移。到了后期，癌细胞反而会上调基质金属蛋白酶、解聚素-金属蛋白酶等表达，降解基质，从而渗入淋巴结和血管向远处转移。

LOX是一种分泌的铜依赖性胺氧化酶，其在翻译后催化ECM中胶原蛋白或弹性蛋白交联。LOX氧化胶原，使肽基赖氨酸和羟基赖氨酸残基脱氨基形成肽氨基己二酸半醛(烯丙基)，随后凝聚。赖氨酰氧化酶样(LOXL)1-4蛋白与LOX作用类似。LOXL2介导的ECM重塑导致ROCK的活化并随后增强HCC局部侵袭。miR-26和miR-29协同抑制LOXL2表达，而这两种miRNA在发生转移的HCC中明显下调。此外miR-26和miR-29不仅在HCC中失调，而且在其他癌症中也被失调。最近在乳腺癌中证实，GATA结合蛋白3介导的miR-29b抑制了一组前转移基因，这些基因主要为HIF靶点[37]。

IL-34鉴定为miR-28-5p的直接靶标，miR-28-5p可抑制IL-34的分泌。IL-34被HCC细胞分泌至细胞外后，与细胞膜上CSF-1R结合，激活局灶性黏附激酶和细胞外信号相关的激酶1和2(ERK1/2)，吸引巨噬细胞作趋化性迁移，聚集至肿瘤细胞附近。招募的肿瘤相关巨噬细胞(tumour-associated macrophages,TAM)分泌各种生长因子、血管生成因子和MMPs等，增强肿瘤细胞的生长、侵袭和转移能力，还可促进肿瘤血管生成。同时，TAM可通过TGF-β途径进一步抑制miR-28-5p的成熟，形成一个正反馈环[38]。

3 结 语

综上所述, 本文着重总结了Wnt、TGF-β信号通路和包括miR-200家族在内的miRNA 在HCC转移过程中的作用。目前已经发现2万多种miRNA，其中与肿瘤相关的miRNA有近千种，但还存在着其他未被发现的信号通路或新的miRNA参与肿瘤的转移。并且这些信号通路及miRNA之间存在着更为复杂的协同或拮抗效应，这些都是需要我们更深入地研究。这些研究可增加我们对肿瘤侵袭和转移机制的理解, 从而开发新的肿瘤治疗方法，为提高患者生存率提供新的希望。