慢性阻塞性肺疾病和支气管哮喘患者社区获得性肺炎时病原学检测情况及分析

余小丽 陈愉生 林明 岳文香 林晓红 胡辛兰

慢性阻塞性肺疾病(COPD)和支气管哮喘是常见的慢性气道疾病，严重危害人民身体健康，目前针对此类疾病合并患有社区获得性肺炎时病原学传统检测方法阳性率低，本课题组研发建立了可检测包括多种细菌和病毒在内的急性呼吸道传染性疾病病原体的液态芯片快速检测技术，具有较好的灵敏度和特异度[1]。本文主要分析我院呼吸科COPD和或支气管哮喘患者患社区获得性肺炎时，使用液态芯片法和实时荧光定量法细菌和病毒的检出情况，现报告如下。

资料与方法

一、研究对象

研究对象为2012年3月至2015年9月福建省立医院呼吸内科慢性阻塞性肺疾病(COPD)和支气管哮喘患者同时符合社区获得性肺炎诊断者。纳入标准：符合下列条件：(1)患者出现咳嗽、痰粘稠，肺部出现湿啰音，并有下列情况之一：①发热；②白细胞总数和(或)中性粒细胞比例增高；③胸部X线显示肺部有浸润性病变；(2)符合2007中华医学会呼吸分会制定的COPD标准[2]和或符合2008年中华医学会呼吸病学分会制定的支气管哮喘标准[3]。排除标准：⑴住院24小时内死亡或自动出院患者；⑵明确或高度怀疑为肺结核、肺部真菌感染患者；⑶艾滋病或人类免疫缺陷病毒感染患者；(4)无痰/肺泡灌洗液。

二、标本收集及处理

收集福建省立医院呼吸内科2012年3月到2015 年9月期间符合要求病例痰或者肺泡灌洗液标本，标本均在入院当天或者第二天早上收集，痰液用痰稀释液消化10分钟，将消化后痰液、肺泡灌洗液分装三份，一份用于微生物细菌培养，另两份冻存于-70℃冰箱中。细菌核酸提取试剂盒为北京艾德莱公司生产。病毒核酸提取试剂盒为Takala公司生产；逆转录试剂盒由北京艾德莱生物科技有限公司生产；PCR试剂盒(DBI-2040 Bestar Taq DNA Polymerase)由上海星汉生物科技有限公司生产；荧光定量PCR试剂盒由上海之江生物技术有限公司生产；所有的试剂均在有效期内使用。多功能流式点阵仪(液相芯片Luminex 100)由美国Luminex公司生产；荧光PCR仪为ABI公司的7500型。

三、实验方法和结果判读

1 微生物细菌培养

应用全自动细菌鉴定药敏仪(VITEK-2)进行检测：按美国临床和实验室标准协会2010年执行标准判断结果。

2 液态芯片方法

液态芯片检测细菌:金黄色葡萄球菌(SA)、肺炎链球菌(SP)、肺炎克雷伯杆菌(KP)、鲍曼不动杆菌(AB)、铜绿假单胞菌(PA)、嗜麦芽窄食单胞菌(SM)。非典型致病菌：肺炎支原体(MP)、肺炎衣原体(CP)；病毒：甲型流感病毒(FLUA)、甲型流感病毒N1型(N1型)、甲型流感H5型(H5型)、巨细胞病毒(HCMV)、腺病毒(AD)、人副流感病毒1-3型(PIV1、PIV2、PIV3)、人偏肺病毒(HMPV)、人博卡病毒(HBOV)、呼吸道合孢病毒(RSV)。检测步骤及判定：按照试剂盒说明书严格操作，提取DNA或RNA，其中RNA逆转录成cDNA，PCR 2个小时，杂交后用Luminex100进行判读，一次可检测12种呼吸道细菌或病毒，7～8小时内完成96份标本的检测。检测MFI(平均荧光强度)≥200则判定为阳性，MFI<150则判为阴性，而150≤MFI<200可判定为可疑阳性，则再进行重复检测样品一次，若检测结果MFI≥150则判定为阳性，若MFI<150则判定为阴性。

3 RT-PCR方法

(1)按照试剂盒说明书严格操作，提取RNA，加入混合液及酶后，应用荧光定量PCR仪(ABI7500)进行检测，一次检测一种病毒，分别检测上述9种(11亚型)病毒。(2)结果判读：通过计算Ct值进行结果判读，FAM UNDET或40，样本低于检测限，报告为阴性；Ct≤38报告为阳性；38≤FAM<40之间，复检一次，如仍为38≤FAM<40，则报告为阴性。

四、统计学处理

数据应用统计软件SPSS 19.0汇总分析，计量资料采用均数±标准差表示，组间比较采用t检验；计数资料以相对数表示，组间比较采用χ2检验；P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

一、COPD和哮喘患者患社区获得性肺炎时细菌感染情况

2012年3月至2015年9月我院呼吸内科COPD和或支气管哮喘患者同时患社区获得性肺炎的住院患者共入选病例113例。以液态芯片法从113例标本中检测出54株细菌，阳性率47.7%(95%CI:43.0%,56.9%)，其中检出肺炎链球菌(SP)13株、金黄色葡萄球菌(SA)3株、肺炎克雷伯杆菌(KP)11株、铜绿假单胞菌(PA )12株、鲍曼不动杆菌(AB)6株、嗜麦芽窄食单胞菌(SM)6株。合计革兰阳性菌16株、革兰阴性菌35株。

传统细菌培养法检出细菌9株，阳性率7.9%(95%CI:2.95%,12.8%)，其中SA 1株、KP 1株、PA 3株、AB 1株、SM 2株。液态芯片法和传统方法相比，细菌总体检出率具有统计学差异(P<0.05)(见表1)。

表1 细菌感染情况

二、COPD和哮喘患者患社区获得性肺炎时病毒和非典型病原菌感染情况

以液态芯片法113例中检出病毒共51株，阳性率45.1%(95%CI:35.9%,54.3%)，其中甲型流感病毒(FLUA)22株、甲型流感H5型(H5型)1株、巨细胞病毒(HCMV) 21株、腺病毒(AD)1株、人副流感病毒1-3型(PIV1、PIV2、PIV3)4株、人偏肺病毒(HMPV)1株、肺炎支原体或衣原体 1株。

RT-PCR法共检出病毒53株，检出率为46.9%(95%CI:37.7%,56.1%)，其中检出FLUA 19株、HCMV 23株、PIV 4株、RSV2株、HMPV 2株、CP+EP 3株。两者病毒总体检出率比较，差异无统计学意义(P>0.05)(见表2)。

表2 病毒及非典型病原菌感染情况

三、COPD和哮喘患者患社区获得性肺炎时下呼吸道混合病原体检出情况

细菌检测以微生物培养法及液态芯片法任一阳性者判定为阳性，病毒检测以液态芯片法或RT-PCR法任一阳性者判定为阳性，113例中同时检出细菌和病毒18例，混合检出率为15.9%(95%CI:9.16%,22.6%)，混合病原菌中巨细胞病毒达12株，肺炎链球菌、肺炎克雷伯杆菌、铜绿假单胞菌合并感染为多。

四、COPD和支气管哮喘病原学分布

113例中单纯患COPD 63例(55.7%)，支气管哮喘35例(31.0%)，COPD合并支气管哮喘15例(13.3%)。按液态芯片法，63例COPD患者检出革兰阴性菌19株，检出率30.2%(95%CI: 18.9%,41.5%)，以铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯杆菌为主；检出革兰阳性菌11株，检出率为17.4%(95%CI:8.0%,26.8%),以肺炎链球菌为主。35例支气管哮喘检出革兰阴性菌11株，检出率31.4%(95%CI:16.0%,46.8%)，铜绿假单胞菌(3株)、肺炎克雷伯杆菌(3株)、鲍曼不动杆菌(3株)、嗜麦芽窄食单胞菌(2株)散在分布；检出革兰阳性菌6株，检出率17.1%(95%CI:4.6%,29.6%)，以肺炎链球菌为主。COPD和支气管哮喘，革兰阴性菌检出率对比，差异无统计学意义(P>0.05)；二者革兰阳性菌检出率对比，差异无统计学意义(P>0.05)。

按RT-PCR法，COPD病毒检出31株，检出率49.2%(95%CI:36.9%,61.5%),支气管哮喘检出病毒11株，检出率31.4%(95%CI:16.0%,46.8%)，均以甲型流感病毒和巨细胞病毒为主；病毒检出率相比，二者差异无统计学意义(P>0.05)。

五、病毒检测阳性者人口学特征、时间分布和基础疾病

入选113例患者中，年龄分布27～91岁，平均年龄70岁，男性83例(73.5%)，女性30例(26.5%), 病毒检测阳性者年龄为71±10岁，病毒检测阴性者年龄为69±12岁，两组年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)(表4)。 RT-PCR法检出甲型流感病毒19株，时间主要分布在3月(7株)和7月(6株)，其他月份分布在4月(2株)、8月(2株)、9月(1株)和10月(1株)。检出巨细胞病毒23株，分布在3、4、5月共8株，7、8月共4株，9、10、11月共6株，12、1月共5株。病毒检测阳性者42例患者中，心功能不全17例，病毒检测阴性者72例患者中心功能不全为24例，两组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)(见表3)。病毒检测阳性者合并有糖尿病2例，合并脑梗塞1例，无合并肺外恶性肿瘤。

表3 病毒阳性者和阴性者年龄和心功能比较

讨 论

慢性阻塞性肺疾病和支气管哮喘是影响人们日常生活质量的重要公众健康问题，随着人口老龄化全球疾病负担逐年增加。细菌、病毒和非典型病原体感染是COPD和支气管哮喘急性加重的重要原因，目前临床上疑似呼吸道感染的常规检查主要依靠微生物实验室诊断及血清学检测，但往往阳性率低，难以做到快速诊断。对于细菌感染方面，本文通过液态芯片法检出细菌的阳性率(47.7%)高于微生物培养法(7.9%)；慢性阻塞性肺疾病和支气管哮喘通过两种检测方法，显示均以检出革兰阴性菌为主，与大部分研究相符[4-7]，国内研究显示革兰阴性菌以铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯杆菌为突出[4-6]，国外Wark PA等学者研究显示以流感嗜血杆菌和铜绿假单胞菌为主[7]。上述研究还可见革兰阴性菌如铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯杆菌、鲍曼不动杆菌等相对于革兰阳性菌如肺炎链球菌多见于反复多次住院患者。从本文研究结果也可得知 COPD和支气管哮喘患者社区获得性肺炎时细菌感染种类相似，反复多次住院者应重视革兰阴性菌感染可能。液态芯片法较高检出率，为临床工作提供帮助之时也存在无法进行药敏试验的弊端；此外COPD和支气管哮喘常常因肺部感染反复加重，发展至结构性肺病呼吸道常存在定植菌可能，故两种方法检测结果都不能排除其为定植菌可能，不能根据结果简单判别为患者的感染病原体，需根据临床信息相互补充共同判断是否为致病原，以指导下一步临床诊疗。

AECOPD 患者中有下呼吸道病毒感染在Mohan A[8]等学者研究中，平均加权流行率为34.1%，另有报道约30%～80%的哮喘急性发作患者中，病毒感染发挥了作用，合并有流感病毒感染的哮喘患者常常需要住院治疗[9]。Perotin JM等学者在COPD急性呼吸道感染前瞻性研究中应用RT-PCR技术发现有44%存在病毒感染，以人鼻病毒(20%)和人偏肺病毒(18%)为多，而流感病毒占6%[10]。本研究COPD和哮喘总体人群以RT-PCR法检测病毒均以甲型流感病毒(16.8%)和巨细胞病毒(19.6%)为主，并且提示这两种气道疾病病毒检出率无差别。与国外学者研究结果差异，可能是由于检测的病毒种类的未完全一致，导致检出率构成比的差异，期待未来更多的研究一起揭示病毒感染构成比情况。

甲型流感在本研究中多在3月和7月，甲型流感病毒感染后，产生的α肿瘤坏死因子及白细胞介素13可提高气道高反应性导致病情加重[11]。流感疫苗是预防流感发病与流行的有效手段[12]，研究中所有病例均未接种流感病毒疫苗，故增强慢性气道疾病人群的流感疫苗接种意识，可有望减少相关疾病负担。巨细胞病毒在本次研究中检出率无明显季节聚集性。巨细胞病毒在人群中感染普遍，常为无症状的隐性感染，在免疫力低下时易于播散感染。部分COPD和哮喘患者长期使用激素，可影响免疫功能状态，增加潜伏巨细胞病毒感染风险。需要指出的是，本次研究检测出病毒阳性是否为本次患者感染的病原尚不能区分，结合HCMV-IgM或IgG血清学检查及临床特点可综合评估是否为现症感染。综合分析基础上早期应用抗病毒治疗可防止病情恶化和缩短住院时间。在检测方法上，本研究病毒和非典型病原体检出率上使用液态芯片法(45.1%)和RT-PCR法(46.9%)均较高，两种方法相比无明显差异，但RT-PCR价格昂贵，一次只能检测一种病毒；液态芯片技术可对同一个微量样本中的多个不同分子同时进行快速的定性、定量分析，价格相对低廉，有望在临床进一步推广。

COPD和支气管哮喘，下呼吸道感染中细菌和病毒也常常合并感染，Mallia等[13]使用鼻病毒感染中度COPD患者发现60%COPD患者病毒感染后发生了继发性细菌感染。本研究细菌和病毒混合检出率为15.9%，以巨细胞病毒合并条件致病菌感染为多。而针对成人巨细胞病毒肺炎合并细菌感染的发病机制研究较少，有待进一步研究。

综上所述，COPD和支气管哮喘社区获得性肺炎时，细菌和病毒均具有较高检出率，部分存在混合感染。液态芯片法可检测细菌、病毒，具有快速、高通量特点，对临床病原学分析可提供重要临床线索，早期进行针对性病原学治疗，可一定程度上减少疾病负担。