宏蛋白质组学在酒曲酶学及蛋白组成功能研究中的应用

□ 左乾程 贵州大学酿酒与食品工程学院

中国酒曲历史悠久，其独特的制作技术可追溯到四五千年前，是世界上最早保存酿酒微生物及其代谢产物的技术。酒曲的发明，是我国古代人民对世界的重要贡献，被称作中国“第五大发明”。中国酒曲种类丰富，包括酿造白酒的大曲、小曲和麸曲以及酿造黄酒的麦曲等。酒曲既是糖化发酵剂，又是酿酒原料，同时也能为酒体提供风味物质和生香前体物质[1]，对酒中的香气和风味物质具有重要贡献，可以说，在一定程度上，酒曲的质量决定了酒的质量。中国酒曲多采用生料制曲，经自然接种，多菌种混合发酵而成，这样做有利于保存原料中的丰富酶系，同时，在制曲过程中，丰富的微生物种群产生了大量的酶类及其他风味物质前体物，这些酶蛋白和风味物质前提物，是实现酒曲功能及构成酒体香气风味的生物化学基础[2]。了解曲中酶和蛋白的组成及功能，对探究酒中风味物质的产生机理及提升酒体风味品质具有重要作用，要研究酒曲的功能，解释其发酵过程的酿造机理，就要从总体上对酒曲的蛋白质进行研究，即进行宏蛋白组学研究。

1 宏蛋白质组学及研究方法

1994年，Wilkins和Williams首次提出了蛋白质组学的概念，它是指细胞、组织或机体所表达的全部蛋白质。蛋白质组学应用范围较广，例如诠释基因组、研究蛋白质的表达及功能，以及蛋白质-蛋白质相互作用等[3]。然而蛋白组学的研究对象一般为纯培养微生物的代谢物、单一细胞或组织[3]。对组成复杂、含有大量未能培养微生物的样品，如酒曲等，蛋白组学的研究就不是很适用。因此，采用宏蛋白质组学对组成复杂的物质的所有蛋白质进行研究就显得非常重要。

宏蛋白质组学的技术流程主要包括：样品（蛋白质）的制备，蛋白分离以及蛋白鉴定。

1.1 样品制备

在酒曲宏蛋白质组学研究中，样品的制备即为酒曲中总蛋白质的提取，这是酒曲宏蛋白组学技术研究的关键及前提，蛋白样品制备的优劣往往决定着后续研究的成败。由于酒曲中微生物菌群组成复杂、差异较大，且酒曲中存在有一定数量的低丰度功能蛋白需要纯化，目前还没有一种提取酒曲宏蛋白的通用方法，因此，在具体的研究过程中，需要根据研究对象的性质及特点，选择合适的方法对酒曲中的总蛋白进行提取。

1.2 蛋白分离

宏蛋白组学研究中常用的蛋白分离方法有两种：双向凝胶电泳及色谱技术。双向凝胶电泳-质谱技术是一种应用较为广泛的经典方法[4]，该方法具备能够对复杂蛋白质混合对象实现鉴定及定量分析的特点，美中不足的是这种技术在分离一些低丰度、疏水性蛋白时，效果不佳。近年来，色谱分离技术及质谱联用技术不断发展，其在蛋白质组学研究中的应用逐渐广泛起来，色谱技术的分辨率和直观性虽然不能与双向凝胶电泳-质谱技术相媲美，但其分离效果却是双向凝胶电泳-质谱技术望尘莫及的，能够获得更加精确的蛋白质信息，色谱技术将会在宏蛋白质组学的研究中得到较为广泛的应用[5]。

1.3 蛋白鉴定

目前，鉴定研究对象中的蛋白质常采用质谱法，常用的有串联质谱（MS/MS）法、基质辅助激光解析时间-飞行质谱（MALDI-TOF/MS）以及四级杆-飞行时间串联质谱（QTOF-MS）。除此之外，蛋白数据库的选择也很关键，要通过了解样品的特性来进行数据库的选择，样品中蛋白质与数据库中蛋白的相似性越高，代表蛋白质鉴定的准确性也就越高。对于样品中未培养的微生物，由于没有对应的蛋白信息，使得蛋白的鉴定存在很大的困难，因此，迫切需要完善宏蛋白质组数据库来进行蛋白鉴定。

2 基于宏蛋白组学技术的中国酒曲研究进展

近年来，随着宏蛋白组技术的不断发展，其越来越多的被应用到了酒曲酶学及蛋白组成功能的研究中，包括了酱香高温大曲、清香中温大曲以及黄酒麦曲的宏蛋白组学研究。了解酒曲中酶和蛋白的组成及功能，对探究酒中风味物质的产生机理及提升其风味品质具有重要作用。

2.1 宏蛋白质组学在酱香高温大曲研究中的应用

宏蛋白质组学在高温大曲研究中的应用主要包括分析比较不同大曲宏蛋白组组成成分的差异、不同发酵条件下大曲微生物分泌胞外蛋白酶的差异，黄永光等[6]对高温大曲中Aspergillus hennebergii菌株在固、液两种状态下生长时的胞外蛋白组进行了比较研究。结果表明固态发酵条件下，Aspergillus hennebergii菌株代谢产生的糖化酶及蛋白酶酶活高于液态发酵条件下的酶活。表明Aspergillus hennebergii菌株在固态发酵条件下能够分泌更多的蛋白酶和糖化酶，从而使白酒的发酵更为顺利，能够产生更多的风味物质。

2.2 宏蛋白质组学在清香中温大曲研究中的应用

目前，宏蛋白质组学主要应用于确定清香中温大曲中酶的微生物来源，为确定清香白酒发酵的功能微生物提供可靠信息。张秀红等[7]对清香白酒酿造使用的3种中高温大曲进行蛋白组学研究，发现大曲中检测到的糖化酶均来自于米根霉，由此认为米根霉为清香白酒大曲中产糖化酶的功能菌。

2.3 宏蛋白质组学在黄酒麦曲研究中的应用

宏蛋白质组学在黄酒麦研究中的应用主要是研究制曲过程中宏蛋白质组的变化情况，进而理解麦曲固态发酵生产机理，以对酒曲质量进行监控。管政兵等[8]对绍兴黄酒麦曲制曲过程中的6个不同时期（起始期、发酵前期、升温期、高温期、降温期与成熟期）进行了蛋白组学研究，双向电泳实验结果表明，麦曲发酵过程中12个蛋白点发生了明显的动态变化。

3 结论与展望

虽然目前宏蛋白组学技术在中国酒曲研究中的应用不多，但蛋白质才是生命活动的主要体现者，酿酒微生物也不例外，因此要研究中国酒曲中微生物与代谢蛋白的功能及其相互关系，宏蛋白组学是较为有效的方法。随着蛋白组学及其相关技术的不断发展，宏蛋白组学将会被越来越多的应用到酒曲研究中。利用宏蛋白组学，可建立酒曲宏蛋白质组的双向电泳标准图谱，并将其应用于实际生产实践，指导生产实践，构建以多酶体系为导向的酿造微化物优化组合，制备优质酒曲，并以酒曲的宏蛋白质组双向电泳标准图谱，判断酒曲品质和生产过程的质量稳定性。