改善卵母细胞体外成熟结局的研究进展

2020-12-03包云柴娟通讯作者卢俏俏师帅郑群邹立波金华市人民医院生殖中心浙江金华321000

医药前沿 2020年18期

包云柴娟（通讯作者）卢俏俏师帅郑群邹立波（金华市人民医院生殖中心浙江金华 321000）

辅助生殖技术的出现和应用为治疗不孕症提供了新的途径。常规的体外受精-胚胎移植通过控制性卵巢刺激技术使相当数量的卵泡同时发育，获得较多的成熟卵母细胞及胚胎数量[1]。然而，在患有多囊卵巢综合征或具有卵巢高反应性的不孕女性中应用超促排卵易导致卵巢过度刺激综合征的发生，不仅影响卵子的质量，降低临床妊娠率，更有危及患者生命的风险[2-4]。

未成熟卵母细胞的体外成熟（in vitro maturation， IVM）技术是从未经促排药物或低剂量药物刺激的卵巢中，通过穿刺手术将未成熟的卵母细胞取出，在体外模拟卵泡内环境促使卵子发育成熟并具有受精能力的一项技术。卵母细胞成熟的标志是减数分裂的启动和完成，这是一个动态的过程，包括细胞核成熟和细胞质成熟。胞核成熟包括生发泡破裂，核膜崩解，同源染色体分离，第一极体排出到卵周间隙。胞质成熟是指细胞的蛋白合成模式改变，蛋白合成后的修饰，细胞质中细胞器的重新排列。只有核质同步成熟的卵母细胞才具备良好的受精能力和胚胎发育潜能。

IVM 技术目前主要应用于治疗多囊卵巢综合征患者、促性腺激素刺激高反应患者、卵巢低反应患者、卵巢早衰和肿瘤患者的生育能力保留等，该技术自1991 年在一名卵巢早衰的妇女体内试验成功后，至今全世界已经有上千名健康婴儿出生[5]。然而，通过IVM 技术培养的卵母细胞仍然存在成熟率偏低的问题，各种文献报道大约在40%～70%之间，且成功受精的比例也不高，后期的胚胎发育潜能差，这些都是导致IVM 技术较常规体外受精-胚胎移植技术成功妊娠率偏低的重要原因。目前亟待解决的难题是如何为未成熟卵母细胞提供与卵泡内微环境相似的培养系统，促使细胞核和细胞质的成熟尽可能同步化。本文就目前国内外在改善IVM 结局上的研究进展做一综述。

1.颗粒细胞共培养在IVM 中的作用

在卵泡发育过程中，颗粒细胞包裹在卵母细胞周围，通过细胞间的缝隙连接与卵母细胞进行双向信息传递，实时调控卵母细胞的生长发育。根据颗粒细胞分布位置的差异，分为壁层颗粒细胞和卵丘颗粒细胞。其中壁层颗粒细胞广泛存在于卵泡液中，研究者从体外获卵后的卵泡液中分离得到壁层颗粒细胞，然后将收集的未成熟的卵母细胞与其共培养，选取发育成熟的卵母细胞进行卵胞浆内单精子注射，结果显示与对照组相比，共培养组的卵子成熟率，受精率，卵裂率和优质胚胎率更高[6]。卵丘颗粒细胞紧密包裹着透明带，惠董娜等[7]在体视显微镜下通过机械分割的方式获得卵丘颗粒细胞，并添加在IVM培养基中，发现卵子成熟率，受精率和优胚率有所提高，后期的的囊胚形成数也更多。由此可见，颗粒细胞共培养可以提高卵母细胞的体外成熟率，改善胚胎发育的结局。卵母细胞体外成熟的过程会影响细胞的基因表达谱，包括参与转录调控，蛋白修饰和细胞周期的众多基因。颗粒细胞共培养在一定程度上模拟了卵巢内的生态环境，也可以减少基因突变的发生[8]。

2.生殖激素在IVM 中的作用

促性腺激素参与了卵泡的整个发育过程，卵泡刺激素（Follicle stimulating hormone，FSH）和黄体生成素（Luteinizing hormone，LH）在窦前卵泡、窦卵泡和排卵前卵泡的发育和成熟的启动和调控发挥重要作用。Javed A 等[9]在小鼠卵母细胞的体外成熟培养液中加入FSH，发现卵泡的直径相比于对照组有所增加，且卵泡存活率，卵母细胞成熟率和生发泡破裂的发生率都显著提高。电镜观察表明，未成熟卵母细胞在添加FSH 的IVM 培养液中培养36 小时后，其滑面内质网、线粒体、皮质颗粒等细胞器的数量增多，细胞器逐步向皮质区迁移，核仁发生致密化。72 小时后，细胞表面的微绒毛形态变得细长且竖起，皮质颗粒呈线性排列，线粒体均匀分布在皮质区中央，这些都是成熟卵母细胞具备的特征。Arroyo A 等[10]研究发现，LH 可以降低排卵前的卵泡环状核苷酸水平，从而使卵母细胞从第一次减数分裂停滞中释放出来。在培养液中加入LH，与LH 受体结合后通过CNP/NPR2 系统和EGF/EGF 受体网络降低环状核苷酸水平，从而激活了成熟促进因子（maturation promoting factor，MPF），活化的MPF 进一步诱导同源染色体分离，完成第一次减数分裂。

3.抗氧化剂在IVM 中的作用

未成熟卵母细胞自身代谢及体外培养操作过程中产生过多的活性氧（reactive oxygenspecies，ROS）导致的氧化应激会导致卵母细胞成熟阻滞、染色体分离异常、基因表达异常、细胞骨架改变及细胞凋亡等，从而影响未成熟卵核和胞质的成熟，降低后续形成胚胎的发育潜能。在IVM 培养液中添加抗氧化剂来平衡过多的ROS，提高细胞的抗氧化水平是目前体外抗氧化应激的主要方式[11,12]。藏红花素是天然的抗氧化剂，Mokhber[13]等的研究结果显示适宜浓度的藏红花素及藏红花水提取物可以增加IVM培养基中谷胱甘肽的浓度，改善卵母细胞细胞核的成熟率，提高胚胎的发育潜能。褪黑素是由松果体分泌的可以调节情绪、睡眠、生殖及昼夜规律的内源性激素，是一种高效自由基清除剂，具有抗氧化的能力。卵泡液中就存在一定浓度的褪黑素，减轻卵母细胞在发育过程中收到的氧化应激损伤。有研究表明在IVM培养液中添加低浓度的褪黑素可以提高卵母细胞的成熟率，受精率，胚胎卵裂率，囊胚形成率和优质囊胚率[14]。

4.能量物质在IVM 中的作用

在卵母细胞的整个发育过程中，葡萄糖和丙酮酸作为能量来源发挥重要功能。GV 期的卵母细胞主要通过消耗葡萄糖维持自身的代谢需求，生发泡破裂后，对丙酮酸的利用率开始上升。在培养液中加入一定浓度的葡萄糖和丙酮酸，培养48 小时，通过时差成像动态观察系统统计第一极体排出的时间，发现添加组的第一极体排出时间更短，获得的成熟卵母细胞的数量更多。