千里光石油醚提取物对LPS激活的炎症反应的抑制效应

杨卉卉，沈金花，刘庆华，彭勇波

中南民族大学生命科学学院/武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室，武汉 430074

炎症反应是机体抵御外界刺激的一种重要防御机制，适当的炎症反应对机体有保护作用，但过度的炎症反应可引发级联放大效应并造成全身炎症反应综合征(SIRS)甚至危及患者的生命[1]。巨噬细胞是机体病理性炎症过程的主要免疫细胞之一[2]，其异常激活能通过响应炎症应答信号，产生大量炎性因子并引发炎症介质的级联释放，从而诱导组织损伤，甚至多功能器官的衰竭等[3]。因此，调控巨噬细胞炎症应答对抗炎及炎性相关疾病的治疗具有重要意义。目前，针对炎症主要采用抗生素治疗，但抗生素的长期使用会产生抗药性、降低机体免疫力并加重肝肾损伤等。因此，从天然中草药中筛选具有显著抗炎效果、安全无毒并且价格低廉的药物已经成为当前动物养殖中开发抗生素替代药物的热点方向之一。

千里光(SenecioscandensBuch.-Ham.)为菊科千里光属多年生草本植物，在我国西藏、陕西及南方多省均有广泛分布，是我国常用的一味传统中药材，临床上多用于急性炎性疾病的治疗。对千里光现代药理学研究表明，其主要含有鞣质、黄酮、酚酸、挥发油、生物碱及萜类等生物活性成分，并主要具有抗炎、抑菌、抗氧化、抗癌及抗病毒等多种药理学作用[4-5]。

近年来,千里光因其广泛的药用价值而得到越来越多学者的关注[4,6]，但目前有关千里光对巨噬细胞炎症调控作用及机制的研究还未见报道。鉴于千里光具有抗炎作用及能治疗多种炎症性疾病的特性，本研究以千里光石油醚提取物(petroleum ether extract ofSenecioscandens，PEESS)为材料，通过CCK-8法检测细胞增殖、Griess法检测NO含量、RT-PCR法及Western blot法检测炎症相关因子表达，综合探讨了千里光的抗炎作用及可能的分子机制，旨在为将其用于动物炎症性疾病的治疗及替代动物养殖中抗生素的使用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

千里光干燥全草购于北京同仁堂武汉药店，产地：湖北。称取经粉碎的千里光细粉500 g，10倍水3次加热回流煎煮后合并滤液并旋蒸浓缩，再经石油醚萃取后旋蒸浓缩提取获得千里光石油醚提取物(浸膏状)并用PBS配制为10 mg/mL的储存液低温保存备用。小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7购于武汉CCTCC细胞库。

1.2 主要药物及试剂

胎牛血清(ScienCell，美国)；DMEM培养基、青霉素-链霉素、0.25%胰酶(Hyclone，美国)；脂多糖(Sigma，美国)；CCK-8试剂盒、反转录试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司)；总RNA快速提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)；RIPA裂解液、总NO检测试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、化学发光显影液ECL Plus(上海碧云天生物技术有限公司)；蛋白酶抑制剂Cocktail(Bimake，美国)；NF-κB p65、MAPK p44/p22及其磷酸化抗体、β-actin抗体(Cell Signaling Technology，美国)；2×PfuPCR Master Mix(北京康为世纪生物科技有限公司)。

1.3 细胞培养与分组处理

将生长状态良好的RAW264.7细胞以2×104/孔的密度接种于12孔板，每孔加1 mL含有10%胎牛血清的DMEM培养基，于37 ℃、5% CO2培养箱培养4 h后，将细胞随机分为5组，即对照组(细胞+培养基)、LPS组(1 μg/mL的LPS+细胞)、试验组(PEESS+1 μg/mL LPS+细胞)，每组5个重复，PEESS预处理RAW264.7细胞质量浓度分别为20、40、80 μg/mL，处理20 h后，添加终质量浓度为1 μg/mL的LPS刺激细胞。

1.4 CCK-8法检测PEESS对RAW264.7的细胞毒性

制备单细胞悬液(2×104个/mL),100 μL/孔接种于96孔板中，培养12 h，再用不同质量浓度的PEESS(20、40和80 μg/mL)处理细胞，24 h后向每个孔中添加10% CCK-8，继续培养2 h，然后用酶标仪在450 nm处测量每个孔中细胞的OD值。细胞活性=(OD加药- OD空白)/(OD对照-OD空白)×100%。

1.5 Griess法检测细胞NO的分泌

制备单细胞悬液(5×104个/mL)，100 μL/孔接种于96孔板中，培养12 h。分组处理细胞后，取细胞上清液50 μL/孔按NO检测试剂盒实验流程操作，然后在540 nm处测定OD值，根据标准曲线计算得到细胞分泌的NO含量。

1.6 RT-PCR法检测炎症相关基因表达

获得细胞后，用Trizol裂解提取RNA，再反转录得到cDNA用于实时荧光定量PCR，以β-actin为内参，目的基因为IL-1β和IL-6。其中，引物序列：IL-1β上游5′-TCTGTCATTCGCTCCCCACAT-3′,下游5′-AGAGAGCACACCAGTCCAAA-3′；IL-6上游5′-TCCAGAAACCGCTATGAAGTTC-3′，下游5′-CACCAGCATCAGTCCCAAGA-3′。

1.7 Western blot法检测细胞NF-κB及MAPK通路表达

用含有磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液裂解RAW264.7细胞，每隔15 min振荡1次，共4次。然后在4 ℃和12 000 r/min下离心15 min。用BCA蛋白质测定试剂盒测定所得蛋白质的浓度。随后，进行电泳，将分离的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上，并在封闭溶液中封闭1 h，然后在4 ℃与一抗(1∶1 000)孵育过夜。之后，将膜与二抗(1∶4 000)在25 ℃孵育1 h。用增强的化学发光试剂检测蛋白质水平，并使用Image J凝胶分析软件对蛋白条带强度进行定量。

1.8 数据分析

试验数据以平均值±标准差(n=3)表示。采用2-ΔΔCt公式计算RT-PCR结果。使用SPSS 22.0、GraphPad Prism 6.0处理数据和绘图，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 PEESS对RAW264.7细胞生长的影响

为排除PEESS细胞毒性对细胞免疫应答的影响，分别用终质量浓度为20、40、80 μg/mL 的PEESS处理细胞，24 h后使用CCK-8测定法测定PEESS对RAW264.7细胞生长的影响。结果显示，利用0～80 μg/mL质量浓度范围内的PEESS处理RAW264.7细胞时，与正常对照组相比，细胞生长无明显变化(图1)，这表明0～80 μg/mL质量浓度可用于后续实验。

2.2 PEESS对LPS刺激RAW264.7细胞NO分泌量的影响

通过测定细胞NO分泌量检测PEESS对LPS刺激RAW264.7细胞炎症应答的调控作用，结果如图2所示，与无LPS刺激的空白对照组相比，LPS刺激RAW264.7可显著提升NO的分泌水平(P<0.01)；而与LPS处理组相比，不同浓度的PEESS则能显著抑制NO的分泌，呈现明显的浓度依赖性(P<0.01)。

图1 PEESS处理后RAW264.7细胞活性

##代表与对照组比较，P<0.01；**代表与LPS刺激组比较，P<0.01。 下同。## means comparing with control,P<0.01；** means comparing with LPS treated-group,P<0.01.The same as below.

2.3 PEESS对LPS刺激RAW264.7细胞炎症相关基因mRNA表达的影响

采用RT-PCR检测炎症相关基因的表达，结果如图3和图4所示，与无LPS刺激对照组比较，LPS刺激RAW264.7细胞24 h能显著提高炎性因子IL-1β和IL-6的表达 (P<0.01)；而与LPS组比较，20、40、80 μg/mL的PEESS则能显著抑制LPS刺激的上述2种炎症因子的表达，并呈现出明显的浓度依赖性(P<0.05)。表明PEESS具有较好的体外抗炎特性，其抗炎机制很可能与其抑制炎症因子表达有关。

2.4 PEESS对LPS刺激的RAW264.7细胞中NF-κB、MAPK途径的影响

NF-κB、MAPK信号通路是炎症反应的重要调控信号通路，为了进一步证实PEESS可能的抗炎机制，采用Western blot法检测PEESS对LPS刺激的RAW264.7细胞NF-κB p65和MAPK p44/42蛋白表达及磷酸化水平，结果如图5所示，LPS处理细胞24 h能显著提高p65和p44/42蛋白的磷酸化水平(P<0.01)；而与LPS组比较，PEESS则显著下调了p65与p44/42蛋白的磷酸化水平(P<0.01)，并对p44/42蛋白的磷酸化水平的抑制作用呈现明显剂量依赖性。上述结果说明PEESS可抑制LPS刺激的RAW264.7细胞中NF-κB、MAPK通路的活化，并呈现一定的剂量依赖性。

图3 PEESS处理后RAW264.7细胞炎症

##代表与对照比较，P<0.01；*代表与LPS组比较，P<0.05；**代表与LPS组比较，P<0.01。 ## means comparing with control,P<0.01；* means comparing with LPS treated-group,P<0.05； ** means comparing with LPS treated-group,P<0.01.

图5 PEESS处理后RAW264.7细胞炎症模型NF-κB和MAPK通路相关蛋白磷酸化水平的变化

3 讨 论

传统用药和临床上，千里光可用于治疗眼部感染、风寒发热、尿路感染、滴虫性阴道炎及荨麻疹等[6]，提示其具有良好的抗炎作用。为进一步探讨博达的千里光抗炎作用及潜在的机制，本研究在千里光石油醚部提取基础上，以LPS 诱导的RAW264.7 巨噬细胞炎症模型为材料，检测了千里光石油醚提取物的体外抗炎作用和抗炎机制。

巨噬细胞是免疫系统中的一道重要防线，在炎症发生过程中至关重要[7]。LPS 刺激小鼠来源的巨噬细胞RAW264.7 可诱导和激活细胞免疫应答，释放NO这一重要的炎症介质，并分泌如IL-1β、IL-6和TNF-α等在内的促炎因子，从而诱发细胞损伤，促进炎症反应[8]。在本研究中，与单纯LPS刺激组细胞比较，添加PEESS能显著抑制NO的分泌及炎性因子IL-1β和IL-6的表达水平，这不仅表明PEESS可能通过降低炎症介质释放和促炎细胞因子的表达从而发挥体外抗炎作用，也与千里光对炎症性疾病具有较好的治疗作用的报道一致[6]。同时，我们也通过CCK-8检测其对细胞增殖毒性的影响排除了千里光提取物的抗炎作用不是依赖于其对RAW264.7 细胞的毒性效应而发挥影响作用。

在LPS刺激的细胞炎性应答机制中，LPS通过Toll样受体家族成员TLR4的介导[9]，激活NF-κB和MAPK信号通路，从而调控LPS诱导的RAW264.7细胞的免疫反应[10]。为了进一步阐明PEESS是否通过影响上述信号通路发挥抗炎作用，本研究进一步检测了PEESS对NF-κB和MAPK信号通路关键信号蛋白表达的影响。NF-κB是连接炎症的关键因子[11]，由p65/RelA、p50、p52、RelB和c-Rel亚基组成，其中p65磷酸化是介导炎症最关键的一步[12]。另一方面，MAPK信号通路可激活AP-1转录因子从而诱导促炎细胞因子的表达分泌[13]，在LPS诱导的促炎信号转导中同样发挥重要作用[14]。本研究的结果表明，PEESS可显著地抑制NF-κB和MAPK信号通路中p65及p44/42蛋白的磷酸化水平，从而发挥抗炎的作用。

综上，PEESS具有良好的抗炎效应，其作用机制可能是通过抑制促炎信号通路NF-κB和MAPK通路中p65及p44/42蛋白的磷酸化，从而抑制促炎细胞因子IL-1β、IL-6等的表达和分泌，但有关上述信号通路相互之间作用，尤其是千里光中具体抗炎活性成分的鉴定还有待进一步的研究。