肿瘤酸性微环境对未成熟树突状细胞迁移能力和F-actin表达的影响*

邱炜， 童璐， 黄瑾， 曾柱

(贵州医科大学 生物与工程学院, 贵州 贵阳 550025)

树突状细胞(dendritic cells, DCs)是一种具有强大抗原摄取和处理能力的抗原提呈细胞，包括未成熟DCs(immol/Lature DCs, imDCs)以及成熟DCs(mature DCs, mDCs)两个分化阶段[1]。imDCs位于皮肤、黏膜等外周组织，主要功能为摄取和处理抗原[1]；获得抗原后，imDCs迁移向二级淋巴组织，迁移过程中逐渐分化为mDCs[1-2]。在肿瘤免疫中，DCs迁移到淋巴结内向初始T细胞呈递肿瘤抗原进而诱导特异性抗肿瘤免疫应答[3-4]，然而实际在癌症患者体内DCs不能有效诱导抗肿瘤免疫应答[4]。越来越多的证据表明，肿瘤微环境对DCs的迁移能力和免疫功能的影响是导致肿瘤免疫逃逸的重要原因之一[5-8]。酸性是肿瘤微环境的一个显著的生物学特性，具有抑制机体抗肿瘤免疫、促进肿瘤侵袭与转移功能[9-11]。肿瘤微环境的pH 5.8～7.4，主要来源于碳酸和乳酸[12]。除此之外，肿瘤细胞还表达空泡质子泵和Na+/H+交换体等离子转运体，将胞内高代谢产生的大量H+泵出胞外，从而导致胞外微环境低pH[13-15]。目前，相关实验分别从酸度和乳酸2个指标来研究肿瘤酸性微环境对DCs免疫功能的影响，主要是检测对其表面分子表达的影响[11]。在肿瘤微环境中，imDCs与肿瘤抗原结合，然后迁移到淋巴结内向初始T细胞呈递肿瘤抗原从而引起免疫应答，迁移过程中imDCs成熟为mDCs[3-4]。本项目通过调节酸度和乳酸来研究肿瘤酸性微环境对imDCs迁移能力和丝状肌动蛋白(filament actin,F-actin)表达的影响，现将结果汇报如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1动物来源 6～8周龄雄性 C57BL/6小鼠20只，体质量20～25 g，购自本校动物实验中心，饲养于温度(22±2)℃、无菌环境下，处理前禁食1 d。

1.1.2主要试剂和仪器 RPMI-1640培养基和10%胎牛血清(美国Gibco公司)，L-(+)-乳酸(美国Sigma公司)，重组鼠粒-巨噬细胞集落刺激因子(recombinat Mouse GM-CSF，rmGM-CSF)和重组鼠白细胞介素4(recombinat Mouse IL-4，rmIL-4；美国Biolegend公司)，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)、Cell Counting Kit 8(CCK8)、罗丹明标记的鬼笔环肽及Triton-X100(北京索莱宝科技有限公司)。CO2培养箱(美国Thermo Fisher公司)，激光共聚焦显微镜(日本Olympus公司)，台式低速离心机(上海安亭科学仪器厂)。

1.2 方法

1.2.1小鼠处理 小鼠麻醉处死，75%浓度酒精浸泡小鼠10 min，将小鼠放置于解剖操作台上、固定四肢。剪下小鼠的后腿、小心剔去附着的肌肉和结缔组织，取出胫骨与股骨，将其浸泡在75%浓度酒精中5 min，放入消毒过的超净工作台上备用。

1.2.2imDCs的诱导及处理 取小鼠股骨与胫骨，无菌剪刀剪断两端，RPMI-1640培养基冲洗骨髓腔，收集冲洗液，1 100 r/min离心5 min，弃上清、加红细胞裂解液，1 100 r/min 离心5 min，弃上清、洗涤，含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养基重悬细胞而获得骨髓细胞悬液。利用rmGM-CSF和rmIL-4定向诱导骨髓细胞7 d 获得小鼠 imDCs后，进行酸度和乳酸处理实验。24 h后收集处理细胞，进行后续实验。

1.2.3细胞活力检测 利用CCK8试剂盒检测imDCs活力。酸度处理实验中，imDCs分为4组，分别加pH7.3(对照)、pH6.8、pH6.5和pH5.8条件的RPMI-1640培养基；乳酸处理实验中，imDCs分为4组，分别加含0(对照)、10、20和40 mmol/L乳酸的RPMI-1640培养基。96孔板中培养各组imDCs(100 μL/孔)24 h，加CCK8溶液(10 μL/孔)，37 ℃、5%CO2条件孵育2 h，用酶标仪在450 nm波长下测量各个孔吸光度。

1.2.4imDCs迁移能力检测 采用Transwell系统测定imDCs的迁移能力。分别收集不同酸度(pH7.3和pH6.5)和乳酸(0和20 mmol/L)处理后的细胞，置于Transwell上室，下室放在预先加入RPMI-1640培养基的孔板中，37 ℃、5% CO2条件下24 h，收集 Transwell下室的细胞，细胞计数板计数，获得的数值与所加入的细胞总数之比为细胞迁移率。

1.2.5共聚焦激光扫描显微镜分析 分别收集酸度(pH7.3和pH6.5)和乳酸 (0和20 mmol/L)处理后的细胞，用4%多聚甲醛常温固定细胞20 min后吸弃，洗涤、加Triton-100、吸弃，加罗丹明标记的鬼笔环肽避光染色12 h、漂洗，加DAPI避光静置5 min、漂洗，加防荧光淬灭剂油后封片、4 ℃避光保存；使用共聚焦激光扫描显微镜观察、拍照、并用ImageJ软件测量细胞荧光强度(F-actin表达量)。每个处理组随机选择3个细胞测定荧光值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 细胞活力

不同酸度处理结果显示，处理imDCs 24 h，与pH7.3组的细胞活力相比，pH6.8和pH6.5组细胞活力差异无统计学意义(P>0.05)，pH5.8组细胞活力下降(P<0.01)；乳酸处理结果显示，与0 mmol/L组细胞活力相比，10和20 mmol/L乳酸组细胞活力的差异无统计学意义(P>0.05)，40 mmol/L组细胞活力明显下降(P<0.01，图1)。因此在后续酸度处理实验中分别将pH7.3和pH6.5处理imDCs 24 h作为对照组和处理组，而乳酸处理实验中分别将0和20 mmol/L浓度处理作为对照组和处理组。

注：(1)与pH7.3组比较，P<0.01；(2)与0 mmol/L组比较，P<0.01。图1 肿瘤酸性微环境对imDCs活力的影响Fig.1 Effects of tumor acidic microenvironment on imDCs viability

2.2 imDCs迁移能力

不同pH处理imDCs 24 h，与pH7.3组相比，pH6.5组imDCs迁移率降低(P<0.05)；乳酸处理imDCs 24 h，与0 mmol/L组相比，20 mmol/L乳酸组imDCs迁移率明显降低(P<0.01，图2)。结果表明，肿瘤酸性微环境显著抑制imDCs的迁移能力。

注：(1)与pH7.3组比较，P<0.05；(2)与0 mmol/L组比较，P<0.01。图2 肿瘤酸性微环境对imDCs迁移能力的影响Fig.2 Effect of tumor acidic microenvironment on migration of imDCs

2.3 肿瘤酸性微环境抑制F-actin的表达

不同酸度处理imDCs 24 h，与pH7.3组相比，pH6.5组F-actin表达明显降低(P<0.01，图3)；乳酸处理imDCs 24 h，与0 mmol/L组相比，20 mmol/L乳酸组F-actin表达明显降低(P<0.01，图4)。结果表明，肿瘤酸性微环境显著抑制imDCs的F-actin表达。

注：(1)与pH7.3组比较，P<0.01。图3 酸度对imDCs 中F-actin表达的影响(600×)Fig.3 Effect of acidity on expression of F-actin in imDCs(600×)

注：(1)与0 mmol/L组比较，P<0.01。图4 乳酸对imDCs 中F-actin表达的影响(600×)Fig.4 Effect of lactic acid on expression of F-actin in imDCs(600×)

3 讨论

基于DCs在机体免疫系统中的重要地位，以DCs为基础的抗肿瘤免疫治疗已成为抗肿瘤治疗手段之一，目前已开发出多种疗法，然而从临床试验结果来看，这些疗法的治疗效率还不尽人意，存在许多待解决问题，包括肿瘤的免疫逃逸、肿瘤抗原的选择和负载方法以及过继回输时间间隔等[1,3]。目前在寻找新的优化DCs肿瘤疫苗的研究中，如何解除肿瘤免疫抑制进而恢复机体中DCs免疫学功能一直是待解决的重要问题[4,12]。因此，通过对肿瘤微环境中DCs生物学功能的研究，为重塑其免疫功能提供理论依据和技术支持，这对抗肿瘤免疫治疗来说具有重要意义。

DCs的迁移能力是发挥其免疫学功能的必要条件[1-2]。在荷瘤宿主体内，DCs不能诱导有效诱导抗肿瘤免疫应答，关键的原因是DCs的迁移能力被抑制[3,16]。酸性微环境是多种实体肿瘤微环境的显著特征，其在肿瘤进展中起到关键作用[17-21]。因此，了解酸性肿瘤微环境对DCs迁移能力的影响对进一步理解肿瘤免疫来说具有重要意义。研究结果发现，肿瘤酸性微环境能显著抑制imDCs迁移，这可能是荷瘤宿主中DCs未能迁移到淋巴结进而导致荷瘤宿主免疫功能受损的重要原因之一。

细胞骨架在维持细胞形态有序性方面起重要作用，主要包括微管、微丝和中间纤维[22-24]。由F-actin构成的微丝能控制细胞迁移能力[24]。F-actin 是多个球状肌动蛋白(G-actin)亚基组成的丝状聚合物[25]。F-actin和G-actin的动态结构对DCs的抗原捕获、迁移能力等功能至关重要[25-27]。在本实验中，罗丹明标记的鬼笔环肽只能特异性标记F-actin，而不是与G-actin结合。结果显示细胞外酸性微环境使imDCs中F-actin含量显著降低，提示酸性微环境可能使F-actin发生了解聚。由于F-actin与DCs的迁移能力密切相关，因此酸性微环境很可能通过调控F-actin聚合进而影响imDCs的迁移能力。

综上所述，本研究发现肿瘤酸性微环境能抑制imDCs迁移能力和F-actin的表达。