长链非编码RNA UCA1 对肺腺癌A549细胞糖代谢及侵袭转移的影响

张卉 王姝 李雪娜 李亚明

中国医科大学附属第一医院核医学科，沈阳 110001

肺癌是世界范围内致死率较高的恶性肿瘤之一，近年来肺癌在我国的发病率和病死率均高居首位，其主要原因在于肺癌的高侵袭转移能力和高复发率[1]。非小细胞肺癌是肺癌中发病率最高的类型，手术治疗和放化疗是最常用和最基本的治疗手段，但预后依然较差，5 年生存率不足17%[2]。因此，研究肺癌的代谢及转移机制在一定程度上能提高肺癌的诊疗效果，进而降低肺癌的病死率。

在RNA 中，大部分为非编码RNA，其中长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）长度一般超过200 bp，且缺乏明显的开放阅读框，因此其不编码蛋白质，但是广泛参与人体生理、病理活动，包括参与或介导肿瘤的发生、发展过程[3-3]。早期研究结果发现，lncRNA 尿路上皮癌胚抗原（urothelial carcinoma associated，UCA）1 在多种肿瘤细胞中表达上调，降低UCA1 的表达可以抑制肿瘤细胞的增殖、转移等生物学行为，调节肿瘤细胞的葡萄糖代谢[4]，因此UCA1 可作为肿瘤早期诊断、预后监测的新型生物标志物[5-6]。

本研究首先通过检测lncRNA UCA1 在肺腺癌A549 细胞中的表达，然后体外实验进一步验证lncRNA UCA1 在肺腺癌中的作用，旨在进一步揭示肺癌的发生、发展机制，并为lncRNA UCA1 作为肺癌新的早期诊断指标及治疗靶点提供证据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

肺腺癌A549 细胞购自中国科学院上海生命科学研究院，人正常支气管上皮细胞HBE 购自中国科学院细胞库，胎牛血清购自美国CLACK 公司，DMEM/F12 细胞培养基、青-链霉素双抗和胰蛋白酶均购自美国Hyclone 公司，Opti-MEM 低血清培养基、Lipofectamine 3000 和Trizol 试剂均购自美国Invitrogen 公司，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒（RR820A）、PrimeScriptTMRT reagent 试 剂 盒（RR047A）购自日本Takara 公司，BCA 蛋白浓度测定试剂盒、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶快速制备试剂盒购自上海碧云天生物技术公司，抗体均购自美国ABcam 公司，Transwell 小室购自美国Corning 公司。18F-FDG由本科室的美国GE 公司的MINItrace 加速器合成，放射化学纯度＞95%。Image Lab 图像分析系统为美国伯乐公司生产，γ 计数器（GC-1500）为安徽中科中佳科学仪器有限公司生产。

1.2 细胞培养及转染

人正常支气管上皮细胞HBE 培养于含有10%胎牛血清的1640 培养基中，肺腺癌A549 细胞培养于含10%胎牛血清和1%双抗DMEM/F12 完全培养基中，均置于37℃的恒温培养箱中培养（内含5%CO2）；然后加1 mL 胰蛋白酶消化收集细胞，再用1 mL 无双抗的完全培养基中和，重悬为细胞悬液，按1×105个数量接种于六孔板中，待细胞密度约为70%时，进行转染。将小干扰RNA（small interfering，siRNA）转染细胞分为NC 组（阴性对照组，转染siRNA-UCA1 序列）和siRNA-UCA1 组（转染siRNA-UCA1 敲降序列），以上序列由上海吉凯公司设计合成。转染24 h 后换液，继续培养24 h 后用Trizol 试剂裂解细胞，用于检测干扰效率。

1.3 UCA1 的干扰效率验证与糖代谢的相关指标检测

提取人正常支气管上皮细胞HBE 和肺腺癌A549 细胞的RNA，进行反转录反应（去除基因组DNA 和反转录反应）和实时荧光定量（quantitative real-time，qRT）PCR 反应，后者包括预变性95℃30 s，反应40 个循环，溶解95℃ 5 s、60℃ 30 s、72℃ 5 s、4℃降温30 s 等步骤。并以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参，通过2-△△CT法计算以上2 种细胞的UCA1 相对表达量，检测肺腺癌A549细胞的糖代谢相关指标：己糖激酶（hexokinase，HK）2、葡萄糖转运蛋白（glucose transporter protein，GLUT）1 和丙酮酸激酶（pyruvate kinase isozymes M，PKM）2 的表达量，以β-actin 为内参。引物序列如下：

GAPDH 引物序列：

正向5′-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3′

反向5′-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3′

β-actin 引物序列：

正向5′-GCAGAAGGAGATCACTGCCCT-3′

反向5′-GCTGATCCACATCTGCTGGAA-3′

UCA1 引物序列：

正向5′-CTCTCCATTGGGTTCACCATTC-3′

反向5′-GCGGCAGGTCTTAAGAGATGAG-3′

GLUT1 引物序列：

正向5′-ATACTCATGACCATCGCGCTAG-3′

反向5′-AAAGAAGGCCACAAAGCCAAAG-3′

HK2 引物序列：

正向5′-GGCAATGAAACCAAAGCCAGGAG-3′

反向5′-GGAAGGAGGAGCCAGAAGCAACC-3′

PKM2 引物序列：

正向5′-GGGTTCGGAGGTTTGATG-3′

反向5′-ACGGCGGTGGCTTCTGT-3′

1.4 Transwell 实验和划痕实验检测细胞侵袭及迁移

肺腺癌A549 细胞转染48 h 后，先用胰蛋白酶消化，再用无血清培养基稀释，以2×105个的数量加入上室中。在下室加入600 μL 含20%血清的DMEM/F12 培养基，将上室放入后继续培养。8 h后取出上室，用4%的多聚甲醛固定30 min，结晶紫染色30 min，用PBS 进行清洗后，擦去上室内残留细胞，晾干拍照。实验至少重复3 次。

细胞转染48 h 后进行划痕实验，用10 μL 加样器的枪头垂直于六孔板划一道竖线，PBS 清洗1 次后进行拍照，更换无血清培养基培养24 h 后再进行拍照，尽量选择同一视野。使用Image J 软件（http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html）测各个时间点细胞未覆盖的面积。

划痕愈合率（%）=1-（各时间点划痕面积/开始的划痕面积×100%）

1.5 Western blot 检测糖代谢相关蛋白

肺腺癌A549 细胞转染48 h 后，用PBS 清洗再加入裂解液，冰上裂解30 min，4℃离心（17 000×g）25 min 后取上清，进行蛋白浓度测定，电泳仪设置电压为80 V 跑电泳，至分离胶和浓缩胶交界处时将电压更改为120 V，至样品跑出即可停止电泳。5%脱脂奶封闭2 h，一抗为HK2（1∶1000）、GLUT1（1∶2000）、PKM2（1∶1000），以β-actin（1∶10000）为内参，4℃ 过夜后，第2 天用TBST（Tris buffered Tween）缓冲液清洗3 次，每次15 min。山羊抗兔二抗（1∶5000）室温孵育2 h，TBST 清洗3 次后进行化学发光法检测和曝光拍照，结果用image-Lab 图像分析系统测定各条带的灰度值，计算HK2、GLUT1 和PKM2 的相对表达量，实验重复3 次。

1.6 18F-FDG 摄取实验

六孔板内未转染的肺腺癌A549 细胞每孔加入37 000 Bq 的18F-FDG，37℃分别孵育5、15、30、60、90、120 min，计算不同时间点18F-FDG 的摄取率，选取摄取率最高的时间点进行后续实验。肺腺癌A549 细胞在六孔板内转染48 h 后，每孔加入0.296 MBq（8 μCi）/mL 的18F-FDG，37℃孵育60 min，吸取上清液后用1 mL 的PBS 清洗3 次。用胰蛋白酶消化细胞，收集后用1 mL 的PBS 再清洗3 次，均加入试管中，最后用γ 计数器测量每个试管内的放射性计数，计算细胞对18F-FDG 的摄取率：18F-FDG 摄取率=细胞内放射性计数/（细胞内放射性计数+上清液放射性计数）×100%。

1.7 统计学分析

以上所有实验均重复3 次以确保结果的可靠性。采用SPSS20.0 软件和GraphPad Prism7.0 软件对数据进行统计学分析。符合正态分布的计量资料用均数±标准差表示，方差齐的2组数据的比较采用t 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 UCA1 在A549 细胞中的表达

用qRT-PCR 检测人正常支气管上皮细胞HBE和肺腺癌A549 细胞中UCA1 的表达时发现，UCA1 在A549 细胞中的表达显著升高，是在HBE中表达量的4.26 倍，且差异有统计学意义（t=16.26，P＜0.001）。

2.2 siRNA-UCA1 对GLUT1、 HK2 和PKM2 的影响

qRT-PCR 结果显示，UCA1 的siRNA 转染能够抑制肺腺癌A549 细胞GLUT1、HK2 和PKM2基因的表达（图1）。进一步的Western blot 结果表明，与NC 组相比，siRNA-UCA1 组的GLUT1、HK2和PKM2 蛋白的表达水平均明显下降，且差异均有统计学意义（图2）。

2.3 LncRNA UCA1 对肺腺癌细胞侵袭和迁移能力的影响

Transwell 侵袭实验结果显示，siRNA-UCA1组和NC 组细胞穿过数量分别为（12.0000±0.5774）、（127.7000±5.9250）个（图3），说明下调UCA1 时，肺腺癌细胞的侵袭能力与对照组相比显著降低（t=19.43，P＜0.001）。

划痕实验结果显示，经过24 h 的爬行，与NC 组相比，siRNA-UCA1 组细胞的迁移运动能力明显降低（图4）。

2.4 siRNA-UCA1 对肺腺癌细胞18F-FDG 摄取率的影响

未转染的肺腺癌A549 细胞在5、15、30、60、90、120 min 时对18F-FDG 的摄取率分别为1.95%、2.28%、2.55%、2.86%、2.40%、2.34%，60 min 时的摄取率达到峰值，因此选择60 min 作为测定的时间点。转染后的肺腺癌A549 细胞测定结果如图5 显示，siRNA-UCA1 组对18F-FDG 的摄取率较NC 组明显降低，且差异有统计学意义。

图1 qRT-PCR 检测3 种基因的表达情况 图中，a：与NC 组相比，差异均有统计学意义（t=19.66、5.81、11.98，均P<0.001）。qRT-PCR：实时荧光定量聚合酶链式反应；siRNA-UCA1：小干扰RNA 下调尿路上皮癌胚抗原1；GLUT：葡萄糖转运蛋白；HK：己糖激酶；PKM：丙酮酸激酶；NC：阴性对照Fig. 1 qRT-PCR was used to detect the expression of three genes

图2 Western blot 检测3 种蛋白的表达情况 图中，a：与NC 组相比，差异均有统计学意义（t=61.35、145.90、88.19，均P<0.001）。siRNA-UCA1：小干扰RNA 下调尿路上皮癌胚抗原1；GLUT：葡萄糖转运蛋白；HK：己糖激酶；PKM：丙酮酸激酶；NC：阴性对照Fig. 2 Western blot was used to detect the expression of three proteins

图3 siRNA-UCA1 对肺腺癌A549 细胞侵袭能力的影响（结晶紫染色，×400） 图中，a：与NC 组相比，差异有统计学意义（t=19.43，P<0.001）。siRNA-UCA1：小干扰RNA 下调尿路上皮癌胚抗原1；NC：阴性对照Fig. 3 Effect of siRNA-urothelial carcinoma associated 1 on the invasive ability of lung adenocarcinoma A549 cells（ crystal violet staining, ×400）

图4 siRNA-UCA1 对肺腺癌A549 细胞迁移能力的影响（×100） 图中，a：与NC 组相比，差异有统计学意义（t=7.71，P=0.002）。siRNA-UCA1：小干扰RNA 下调尿路上皮癌胚抗原1；NC：阴性对照Fig. 4 Effect of siRNA-urothelial carcinoma associated 1 on the migration ability of lung adenocarcinoma A549 cells（×100）

图5 siRNA-UCA1 对肺腺癌A549 细胞18F-FDG 摄取率的影响 图中，a：与NC 组相比，差异有统计学意义(t=5.79，P=0.004)。siRNA-UCA1：小干扰RNA 下调尿路上皮癌胚抗原1；FDG：氟脱氧葡萄糖；NC：阴性对照Fig. 5 Effect of siRNA-urothelial carcinoma associated 1 on the 18F-FDG uptake rate of lung adenocarcinoma A549 cells

3 讨论

目前针对恶性肿瘤的治疗手段包括手术切除并行同步放化疗，但整体预后仍不理想[7]。因此，研究肺癌病变的确切机制和发现新的关键靶点至关重要，对开展肺腺癌患者的个体化治疗和改善预后具有重要意义。

代谢重编程是肿瘤细胞的标志之一，并且与细胞生长调节的过程密切相关[8]。FDG 是一类葡萄糖类似物，可以反映葡萄糖的代谢情况。近年来随着PET 类的医学成像设备被临床广泛应用，FDG可以用于肿瘤的诊断、分期和治疗监测。由于细胞在快速增殖侵袭过程中所需的能量会急剧增加，可加快肿瘤发生发展的进程[9-10]，因此研究肿瘤的代谢调节过程有利于寻找更好的治疗靶点。而lncRNA最开始被认为是基因转录的副产物，不存在生物学功能[11]。但近年来的研究结果表明，lncRNA 与肿瘤的发生发展有密切关系，已成为基因组学新的研究热点[12-13]。

目前，有研究结果表明UCA1 在肺癌细胞中呈高表达状态，并且可以促进小细胞肺癌的生长、侵袭和迁移[14-15]，与本研究的结果一致。除此之外，本研究还通过qRT-PCR 及Western blot 实验检测UCA1 在A549 细胞糖代谢中的关键酶，发现下调UCA1 后，GLUT1、HK2 和PKM2 表达均显著降低，抑制细胞糖代谢的过程，这在国内外尚无报道。我们用Transwell 侵袭实验和划痕实验进行生物学行为的检测，结果表明，下调UCA1 后会使A549 细胞的侵袭和迁移能力显著下降，但具体机制仍需要进一步探索。有研究者发现，UCA1 在胰腺癌中可以通过Hippo 通路促进胰腺癌细胞侵袭和转移[16]；对肝细胞癌的研究发现，UCA1 可以通过与miR-203 结合，激活转录因子Snail 2，促进肝癌细胞的增殖和侵袭[17]。因此，UCA1 沉默后，相应糖代谢指标表达降低，抑制肿瘤的能量代谢，使肿瘤侵袭转移能力下降。

综上所述，本研究发现UCA1 可以影响糖代谢的关键酶，并且促进肺腺癌A549 细胞的迁移和侵袭，这提示其可能在肺癌发生过程中起到癌基因的作用，有望成为肺癌治疗的潜在新靶点。本研究结果为进一步深入探讨UCA1 对促进肺癌细胞恶性生物学特征的分子机制奠定了基础。由于我们只进行了体外实验，尚存在不足之处，比如UCA1与临床病理因素及预后的关系等都值得进一步研究。接下来将进行机制研究，深入探讨UCA1 通过哪种信号通路对糖代谢指标进行调节，同时加上体外动物实验进行验证，以得到更明确的治疗效果。

利益冲突本研究由署名作者按以下贡献声明独立开展，不涉及任何利益冲突。

作者贡献声明张卉负责试验的设计与实施、论文的撰写；王姝负责数据的分析；李雪娜、李亚明负责论文的审阅与修订。