冰冻核酸标本质量控制对检测结果的影响①

刘 静,陈 岩

(佳木斯市中心血站 检验科，黑龙江 佳木斯 154002)

核酸检测技术(nu-cleic acid amplification testing,NAT)是一新兴的血液传染病检测方法，能显著缩短血液感染病毒的“窗口期”，降低经输血途径传播病毒的风险[1]。随着血站血液筛查实验室将血液核酸检测技术的引入，核酸检测已经成为确保血液安全性的重要技术之一。分析前的质量控制包括病人准备、标本采集储存及运输等过程[2]。做好核酸检测分析前的质量控制才能使核酸检测更安全可靠。我市中心血站是中小型血站，标本量小，实验室周末不进行实验，周五周六采集的标本需冻存，待周一酶免检测完成后，周二进行核酸检测。另外我站还承担3个中心血库的核酸集中检测工作，3个血库路途遥远，不能每日及时送检至本站，部分核酸标本需要冰冻，所以做好冰冻核酸标本的质量控制尤为重要。本血站在做好冰冻核酸标本的质量控制下，对冰冻核酸样本检测结果进行了综合分析评价，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 资料来源

2016-01～2017-12献血者血液核酸检测标本。2016～2017年佳木斯市中心血站共检测无偿献血者核酸标本47753人次，共拆分64次，取512份标本作为实验组。实验组的512份核酸标本拆分实验结束后冻存在-30℃以下72h以上，作为对照组。实验前1h放置室温平衡、复融进行核酸检测。

1.2 检测方法

1.2.1 仪器: 浩源核酸汇集提取系统(ChiTas BSS1200)；ABI7500扩增仪；松下医用低温箱(MDF-U5412N)。

1.2.2 试剂: 乙型肝炎病毒 丙型肝炎病毒 人类免疫缺陷病毒(1型)核酸检测试剂盒(PCR-荧光法)试剂盒；HBV DNA 标准物质、HCV RNA 标准物质、HIV RNA 标准物质(康彻斯坦生物)。

1.3 检测方法

实验组：对日常ELISA检测阴性的标本进行核酸8人份混合样本模式进行检测，若混样检测反应性，再进行拆分，即核酸单检，单检呈反应性判断为NAT阳性，单检呈无反应性判断为阴性。混样检测反应性，再进行拆分的标本入组。拆分的标本号及检测结果进行记录。

对照组：将实验组的标本冻存72h以上进行单检，单检呈反应性判断为NAT阳性，单检呈无反应性判断为阴性。标本号及检测结果进行记录。

1.4 数据统计

统计实验组和对照组的阴阳性实验结果和标本号，检出的阴阳性实验结果和标本号一致，无差异 。

2 结果

2.1 实验组和对照组阳性结果比较

2016～2017年混样检测反应性，再进行拆分的标本冻存后进行检测，检出的阳性标本实验结果无差异(P>0.05)。见表1。

表1 2016～2017年实验组和对照组数据

2.2 NAT检测结果统计

2016～2017年佳木斯市中心血站共检测无偿献血者核酸标本47753人次，共拆分64次，拆分率为0.84%，拆分阳性数为26人次，其中25人次是HBV阳性，1人次是HIV阳性。阳性率为0.054%。2016年共拆分38次，拆分的样本数为304人次，检出的阳性样本15人次。2017年共拆分26次，拆分的样本数为208人次，检出的阳性样本11人次。核酸阳性标本的检出率符合我国东部地区采供血机构的流行病学趋势。见表2。

表2 2016～2017年无偿献血者核酸标本检测

3 讨论

做好冰冻的核酸标本的检测应对标本从两方面进行质量控制。第一，核酸标本冻存前应观察标本是否存在溶血、脂血、凝块。因为溶血的标本中含有血红素，血红素可通过其卟啉环与Taq酶的不可逆结合而抑制Taq酶活性，可影响PCR扩增检测[3]。脂血的标本在加样过程中干扰加样针对液面的探测，容易加样不足量。而且对荧光的屏蔽和吸收作用有干扰，影响检测结果。凝块的标本易在检测加样过程中吸到凝块，导致加样量不足。而且在加样过程中会形成拖带、拉丝现象，造成标本间的污染；而且有的加样仪器当监测到标本有异常情况时，它会自动终止实验，造成很大的浪费[4]。上述的标本不适合做核酸检测，更不适合冻存后进行核酸检测。第二，冻存后的核酸标本在检测前的处理。于实验开始前将核酸标本从冰箱取出，置18～25℃平衡室温1h后颠倒混匀，随即进行检测。因为核酸片段在血浆中向下沉降，易吸附在试管壁、分离胶上面，故颠倒混匀这一操作步骤对检出率影响很大。此外还应该注意，DNA样本切忌反复冻融，若DNA样本长期存放于-20℃环境或实验过程中反复多次冻融，则易发生降解[5]；避免冰冻标本二次离心，会使冻融后破裂溢出的细胞液从分离胶下层进入到分离胶上层，不仅稀释标本浓度，还会抑制核酸扩增反应。

综上，做好冰冻核酸标本质量的控制，才能保证冰冻核酸标本检测结果的安全可靠。对于一份核酸样本检测结果的判断，还需要我们多方面因素考虑，不可大意。目前核酸项目对于采供血机构开展的时间并不长，我们还需探索发现，完善血液筛查工作。