细叶小檗叶中总黄酮含量测定①

吴莉莉，白术杰，王书红，张羽男

(佳木斯大学药学院， 黑龙江 佳木斯 154007)

细叶小檗(Berberis poiretii Schneid)是小檗科小檗属的植物。别名三颗针、针雀，分布于俄罗斯、朝鲜、蒙古以及中国大陆的黑龙江、吉林、山西等地，生长于海拔600～2,300米的地区，目前尚未由人工引种栽培。根、根皮中含有多种生物碱，主要为小檗碱，功效是清热燥湿、泻火解毒、健胃。用治疗吐泻、痢疾、咳嗽、胆囊炎、目赤、口疮、无名肿毒、湿疹、烧、烫伤、高血压症。但细叶小檗叶的总黄酮含量测定未见报道。现对东北地区的细叶小檗叶的总黄酮进行提取及含量测定，为细叶小檗叶资源的合理开发和利用提供试验依据。

1 材料与仪器

1.1 试验材料

样品采自黑龙江省伊春市嘉荫县山区，由佳木斯大学药学院宗希明老师鉴定为细叶小檗叶。

1.2 仪器与试剂

UV-757CRT型紫外可见分光光度计[1](上海精科学仪器有限公司)，RE-52A型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)，SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)，UV-1型三用紫外分析仪(上海市安亭电子仪器厂)，KQ 5200型超声波清洗器(江苏昆山仪器厂)，101-Ⅲ型电热鼓风恒温干燥箱(江苏大地自动化仪器厂)，98-1-B 型电子调温电热套(天津市泰斯特仪器有限公司)。

芦丁标准品为中国药品生物制品鉴定所购买，所用硅胶G为青岛海洋化工集团公司生产，氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠、三氯化铝、镁粉、甲醇、95%乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、冰醋酸、正丁醇、盐酸、浓硫酸等试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 黄酮检识试验

在进行含量测定之前，对细叶小檗叶采用试管试验、纸色谱、薄层色谱进行了盐酸镁粉反应、三氯化铝反应、乙酸镁反应等黄酮检识试验，见表1。

表1 样品的黄酮检识反应结果

细叶小檗叶提取液的黄酮检测结果均为正反应，实验结果显示该植物中含有黄酮类化合物。

2.2 最大吸收波长的选择

精密称取 120 ℃干燥至恒重的芦丁[2]对照品19.03mg，置于50mL容量瓶中，用甲醇完全溶解并定容，芦丁对照品浓度为，分别取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL于25mL(标号为标1～7)的容量瓶中，以甲醇为溶剂，亚硝酸钠、硝酸铝[3]和氢氧化钠为显示剂，分别以吸光度(A)为纵坐标，波长(λ)为横坐标作图，得到吸收曲线，细叶小檗叶和芦丁标准品的吸收曲线 ，均在510nm处有一强吸收最大吸收波，因此选择510nm为测定波长。

2.3 芦丁标准曲线的制备

将已制备好的7个芦丁对照品溶液置于紫外分光光度计中，在200～800nm(间隔1nm)下全波长扫描[4]，样品检测波长在510nm处分别测定吸光度；以吸光度值A为纵坐标，对照品溶液质量浓度 C 为横坐标，得到回归方程和相关系数绘制标准曲线。结果显示芦丁浓度在0.0156～0.0468mg/mL间具有良好的线性关系，回归方程为C=0.0471A-0.0128，r=0.9988，得到芦丁的标准曲线见图1。

图1 芦丁的标准曲线

2.4 提取工艺研究

取干燥细叶小檗叶粗粉60g平均分成2份，分别用10倍量的65%的乙醇[5]和95%的乙醇[6]浸泡1h超声(功率 250 W ，频率40kHz)提取法[7]提取2次，时间30min，温度60℃合并提取液，过滤，滤液回收乙醇并浓缩为2份墨绿色浸膏。分别将浸膏加水体积比1：1.5分散后分别用石油醚、氯仿、乙酸乙脂、正丁醇进行梯度萃取。弃去石油醚萃取液，其它萃取液分别回收溶剂后合并后得2份提取物分别加甲醇 50mL溶解过滤过滤至 100mL容量瓶中，残渣和容器用少量甲醇多次洗涤，洗液加入容量瓶中，加甲醇稀释至刻度[8]，摇匀。65%的乙醇提取物为检液Ⅰ、95%的乙醇提取物为检液Ⅱ。取干燥细叶小檗叶粗粉约10g分成2份分别包入滤纸中置2个索氏提取器中水浴回流提取，各加石油醚180mL,回流 2h，弃去石油醚液，分别加65%乙醇，95%乙醇150mL,水浴回流提取2h，回收溶剂后加甲醇定容于100mL容量瓶中65%乙醇提取物为检液III、95%乙醇为检液IV。

精密量取检液Ⅰ、检液Ⅱ、检液III、检液IV各2mL，分别置25mL容量瓶中，按标准曲线制备项下先加5%亚硝酸钠1.0mL，6min后加10%硝酸铝1.0mL，6min后加4%氢氧化钠10mL，加甲醇至刻度摇匀后室温放置15min后，依次测定吸光度，计算出细叶小檗叶总黄酮含量，结果见表2。

式中x：总黄酮含量，%；

C1：检测液中总黄酮浓度，mg/mL；

V1：检测液处理后的体积，mL；

V： 配制的检测液总体积，mL；

V2：样品中检测液的体积，mL；

W：小檗叶样品干重，mg。

表2 细叶小檗叶的总黄酮含量检测

2.5 结果

根据表2分析数据得出以下结论：检液Ⅰ总黄酮含量 0.513%、检液Ⅱ为 0.291%、检液III为0.498%、检液IV为0.288%。细叶小檗叶在提取溶剂为 65% 乙醇，超声功率为 462W，超声时间为30min，超声温度为60℃的超声条件下总黄酮提取率最高。

3 讨论

取干燥细叶小檗叶粗粉进行活性成分的提取、并做了黄酮检识试验，结果均为正反应，证明细叶小檗叶中含有黄酮成分。分别取不同浓度乙醇为溶剂采用超声波及连续回流提取法分别对细叶小檗叶中总黄酮成分进行提取，采用比色法对检液Ⅰ、Ⅱ、III、IV依次进行总黄酮含量测定。结果显示不同溶剂和不同提取方法得到总黄酮含量也有差别。检测结果分别为0.513%、0.291%、0.498%、0.288%。因此以65% 乙醇为溶剂，超声波提取方法，适用细叶小檗叶中总黄酮含量测定。为合理开发细叶小檗叶提供试验依据，细叶小檗叶可以成为黄酮新药资源。