三株柑橘溃疡病生防内生细菌对脐橙感染溃疡病后几种防御酶活性的影响

赖家豪，宋水林，刘 冰

(江西农业大学 农学院，江西 南昌 330045)

赣南纽荷尔脐橙是江西省最重要的经济作物之一，是赣南地区重要的收入增长点[1]，目前其生产受到多种病害的威胁，其中溃疡病的发生尤为严重[2]。柑橘溃疡病是由柑橘黄单胞杆菌(Xanthomonascitripv.citri)引起的柑橘毁灭性病害，被世界许多国家列为重要的检疫性病害[3-4]。该病主要危害柑橘叶片、枝梢和果实，引起落叶、枯枝、树势衰弱、果品价值下降，给柑橘产业带来巨大的经济损失[5]。长期以来，柑橘溃疡病的防治主要依赖化学药剂，在一定程度上造成了病菌抗药性的产生，导致该病的发生在某些地区有蔓延加重的趋势[3]。因此，化学药剂的频繁使用对江西脐橙产业的可持续发展造成了很大影响。

近年来，生物防治作为一种环保、绿色的防治方法逐渐受到了人们的关注，一些植物病害生防菌的防病机理研究也取得了瞩目的成绩，比如生防微生物在作物根部的定殖能力是决定生防效果的关键[6]。此外，防御酶活性是寄主防卫反应能力的重要指标，植物的一些防御酶活性及其升高速度与其对某些病原物的抗病性密切相关，比如植物体内苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)等保护酶与植物抵抗病原菌入侵有密切关系[7-9]。大量文献报道，一些生防菌防病的重要机理之一就是激活寄主的某些防御酶[10]。

本实验室在前期工作中筛选到3株(GN222、GN223和GN232)对脐橙溃疡病有较好防治效果的内生细菌[11-12]，为明确其防病机理，本试验检测了3株细菌对纽荷尔脐橙树体几种防御酶活性的影响，以期为这3株内生细菌的开发利用和柑橘溃疡病的生物防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

实验植物来源于江西农业大学生态园纽荷尔脐橙健康植株。

柑橘溃疡病菌Xanthomonascitripv.citri(Xcc)，生防内生细菌GN222、GN223和GN232均由江西农业大学植物病理学实验室分离保存。试验前将菌种在NA培养基上进行活化，并配制成106CFU·mL-1的菌悬液备用。

所使用仪器包括T5新世纪型分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)，高速冷冻离心机(Eppendorf)，数显电热培养箱(上海博迅医疗生物仪器股份有限公司)等。

1.2 方法

1.2.1 脐橙枝条的接种与处理

在果园中选取健康脐橙枝条，分别喷施GN222、GN223和GN232菌悬液，以喷施清水为对照，保湿1 d后使用针刺法接种柑橘溃疡病病菌，再次保湿24 h，于接种病菌后第2天开始取样，每日摘取叶片放入自封袋并放入-80 ℃冰箱保存用于提取粗酶液，共取样7 d。每个样品3个重复。

1.2.2 防御酶活测定

粗酶提取液的制备：称取1 g脐橙叶片，放入预冷的研钵中，加入3 mL提取液(0.1 mol·L-1pH 8.8硼酸钠缓冲液，内含5 mmol·L-1巯基乙醇、1 mmol·L-1EDTA-Na2)，0.1 g PVP，冰浴研磨成匀浆，转入离心管，再用2 mL提取液冲洗研钵及研棒然后一并转入离心管，在4 ℃下10 000×g离心30 min。上清液即为PAL、POD、SOD、PPO和CAT粗酶液，置于-20 ℃冰箱中保存备用[13]。

酶活性的测定：PAL活性以每克样品(鲜重)每小时D290变化0.01为一个酶活力单位[14]；PPO活性以每克样品(鲜重)每分钟D398值变化0.01为一个酶活力单位[13]；POD测定采用愈创木酚法，以每克样品(鲜重)每分钟D470变化0.1为一个酶活性单位；SOD活性测定采用邻苯三酚法，在测定邻苯三酚自氧化速率的基础上，以每分钟每克样品(鲜重)的反应体系对邻苯三酚自氧化速率抑制达50%为一个酶活性单位[13，15-16]；CAT活性以每克样品(鲜重)每分钟D240值降低0.043 6为1个酶活性单位[17]。

1.3 数据处理

试验数据利用Excel 2007和SPSS 19.0软件进行作图和分析，采用Duncan氏新复极差法进行处理间的差异显著性检验。

2 结果与分析

从图1可以看出，脐橙树体内PAL活性在受到外界生物刺激时会明显增强。单独接种溃疡菌的脐橙树，其体内PAL活性在接种病菌第2天达到最高，后逐渐降低。先接种内生细菌再接种溃疡菌的脐橙树，其体内PAL活性则会出现2个高峰。对于接种菌株GN222的脐橙树，树体在接种病菌第2天体内PAL活性出现第一个高峰(达到39.48 U·g-1)，在接种病菌第5天PAL活性出现第二个高峰(达到38.60 U·g-1)，接种第7天后明显下降；接种菌株GN223的脐橙树，其体内PAL活性在接种病菌第1天较高，后逐渐降低，第5天后又开始逐渐升高，但差异不明显；接种菌株GN232的脐橙树，其体内PAL活性出现的2个高峰期分别为接种病菌第1天和第5天，同样差异显著。可见，脐橙树在感染溃疡病菌过程中，几株生防内生细菌的介入对其体内PAL活性具有诱导和增强作用，在接种病菌后第1～7天，除了GN222处理外，其他处理的树体PAL活性变化差异较小。

从图2可以看出，单独接种溃疡菌的脐橙树，其体内POD活性在接种病菌第4天达到高峰。先接种内生细菌再接种溃疡病菌的脐橙树，其体内POD活性则会出现2个高峰。接种菌株GN222的脐橙树，树体在接种病菌后第2天时体内POD活性出现第一个高峰，在接种病菌第6天POD活性出现第二个高峰；接种菌株GN223和GN232的脐橙树，在接种病菌第1天其体内POD活性均较高，后逐渐降低，在接种病菌第5天出现第二个高峰。总体来说，接种GN223的脐橙树体内POD活性增强最明显，而接种GN232的树体内POD较弱。可见，脐橙树在感染溃疡病菌过程中，生防内生细菌GN223的介入对其体内POD活性具有明显的诱导和增强作用。

图2 三株内生细菌对脐橙感染溃疡病菌过程中过氧化物酶(POD)活性的影响Fig.2 Effects of 3 endophytic bacteria on the activity of POD in navel orange infected by Xanthomonas citri pv.citri

从图3可以看出，单独接种溃疡菌的脐橙树，其体内PPO活性在接种病菌第3天达到高峰，第4天后逐渐下降。先接种内生细菌再接种溃疡菌的脐橙树，其体内PPO活性因接种内生细菌种类的不同而有明显差异。对于接种菌株GN222的脐橙树，树体在接种病菌第2天体内PPO活性出现高峰，后下降且第3天稳定在46.67U·g-1；接种菌株GN223的脐橙树，其体内PPO活性持续增高，在接种病菌第5天出现高峰期，后逐渐降低；接种菌株GN232的脐橙树，其体内PPO活性在接种病菌第2天较高，后逐渐降低，5 d后又开始逐渐升高。可见，脐橙树在感染溃疡病菌过程中，3株生防内生细菌的介入对其体内PPO活性均具有诱导作用，但活性强度小于病菌对树体内PPO活性的诱导。

图中数据为平均数±标准差。同色柱上不同字母表示经Duncan氏新复极差法检验在P<0.05水平差异显著。下同。Data in the figure are mean±SD.Different lowercase letters on the bars of the same color indicated significant difference at P<0.05 level by Duncan’s new multiple range test.The same as below.图1 三株内生细菌对脐橙感染溃疡病菌过程中苯丙氨酸解氨酶(PAL)的影响Fig.1 Effects of 3 endophytic bacteria on the activity of PAL in navel orange infected by Xanthomonas citri pv.citri

图3 三株内生细菌对脐橙感染溃疡病菌过程中多酚氧化酶(PPO)的影响Fig.3 Effects of 3 endophytic bacteria on the activity of PPO in navel orange infected by Xanthomonas citri pv.citri

从图4可以看出，单独接种溃疡菌的脐橙树，其体内SOD活性在接种病菌第1天达到高峰，后逐渐下降。先接种内生细菌再接种溃疡菌的脐橙树，其体内SOD活性均在接种溃疡病菌第1天达到第一个高峰，在第4天达到第二个高峰。但同对脐橙体内PPO活性的诱导相似，3株内生细菌的介入虽然导致脐橙树体内PPO活性再次升高，但强度要低于溃疡病菌诱导树体产生的PPO活性。

图4 三株内生细菌对脐橙感染溃疡病菌过程中超氧化物歧化酶(SOD)的影响Fig.4 Effects of 3 endophytic bacteria on the activity of SOD in navel orange infected by Xanthomonas citri pv.citri

从图5可以看出，单独接种溃疡菌的脐橙树，其体内CAT活性在接种病菌第1天达到高峰，后逐渐下降。先接种内生细菌再接种溃疡菌的脐橙树，除了接种GN223菌株的脐橙树在接种病菌第2天达到了第一个CAT活性高峰外，其他的均在接种病菌第1天达到第一个高峰。对于接种菌株GN222和GN223的脐橙树，其树体均在接种病菌第5天体内CAT活性出现第二个高峰；接种菌株GN232的脐橙树，其体内CAT活性则在接种病菌第3天出现第二个高峰。可见，脐橙树在感染溃疡病菌过程中，3株生防内生细菌的介入对其体内CAT活性均具有增强作用，但不同的内生细菌对寄主CAT活性的增强时间和强度差异明显，其中GN222对脐橙CAT活性影响程度最大。

图5 三株内生细菌对脐橙感染溃疡病菌过程中过氧化氢酶(CAT)的影响Fig.5 Effects of 3 endophytic bacteria on the activity of CAT in navel orange infected by Xanthomonas citri pv.citri

3 结论与讨论

内生细菌是一类可用于植物病害生物防治的优良资源，其在防治植物病害方面具有其他生防因子不可比拟的优势和潜力，成为近些年研究的热点[18]。大量报道证明，可以有效定殖在植物体内，通过多种作用方式与病原菌做斗争，从而达到防治病害的目的。目前的研究表明，内生细菌的防病机理主要是与寄主竞争生态位和营养、产生抗菌物质、诱导植物抗性和干扰植物病原菌群体感应(QS)，其中诱导植物产生系统抗性(ISR)是内生细菌防病的最重要机理之一[19]。而在植物复杂的抗病系统中，防御酶活性的变化是一个重要的表现指标，如SOD、POD、PPO和CAT等。

目前，内生细菌用于防治柑橘溃疡病的相关研究尚处于起步阶段，尤其防病机理研究更是欠缺。如Caicedo等[20]从柑橘叶片中分离出的3株溃疡病生防细菌，主要是通过干扰病菌的群体感应信号达到减轻病害症状的目的；谭小艳等[21]从柑橘叶片中分离到的内生洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderiacepacia)Bc51对溃疡斑有60.3%的抑制效果，但对其防治机理未曾进行研究；陈娇梅等[22]从柑橘不同器官中分离获得并筛选出3株对柑橘溃疡病有良好防效的芽孢杆菌，其防病机制可能与蛋白酶与纤维素酶有关，但对此并未进行确定和深入研究；刘冰等[12]获得内生枯草芽孢杆菌对柑橘溃疡病具有较好的防效，研究了其抑菌活性粗提物的稳定性，对其他机理并未涉及。可见，对内生细菌防治柑橘溃疡病的研究还需要进一步深入。

本试验使用的3株生防细菌来自于柑橘叶片和果实，对柑橘溃疡病有较好的防治效果[23]。在前期研究中对其进行了鉴定，将菌株GN222归为Bacillussp.，GN223归为Kosakoniacowanii，GN232归为Bacillussubtilis[23]。这3株内生细菌中，GN222和GN232对柑橘溃疡病菌的生长具有明显的抑制作用，而GN223仅有轻微的抑菌作用。为了解这些菌株防治溃疡病的机理，本试验检测了在溃疡病感染情况下其对脐橙树体几种防御酶的影响。结果表明，在感染溃疡病菌的情况下，3株内生细菌均可不同程度地诱导和增强脐橙树体内防御酶的活性，但是不同菌株对增强酶活性的时间和幅度有明显差异。试验结果可为3株内生细菌应用于柑橘溃疡病的生物防治提供理论依据，亦可为内生细菌与脐橙之间的互作研究提供参考。