基于宏基因组的二代测序技术对下呼吸道感染诊断价值的综述

房利利，张 永

(蚌埠医学院第一附属医院呼吸与危重症医学科，安徽 蚌埠 233000)

感染性疾病是世界公共卫生挑战，在2016年的全球健康评估中，下呼吸道感染仍然位居低收入国家死亡首位，严重威胁着人类的生命健康[1-2]。目前，临床常用的病原学检查技术(显微镜检查、培养、血清学及传统分子生物学手段)常常存在阳性率低、漏诊率高、时效性差等局限。病原学诊断不明确导致治疗延后、药物滥用、耐药性增加、经验抗感染治疗等现象。因此，肺部感染病原学的精准诊断对于优化抗感染治疗至关重要。二代测序技术的出现开启了微生物宏基因组学领域，也开启了感染性疾病病原体的精准诊断新篇章。

1 二代测序技术(next-generation sequen-cing,NGS)

二代测序也称为高通量测序或大规模并行测序，该方法使得数以亿计的基因片段同时或独立测序，可以从时间、效率和成本上让微生物组研究成为可能。该技术总体可分为宏基因组测序(metagenomics next-gennerationsequencing,mNGS)和靶向扩增子测序(targeted-ampliconsequencing,TAS)，其一般测序流程包括标本中核酸提取、DNA和(或)RNA富集、文库制备、高通量测序和生物信息学分析等。mNGS是对整个DNA和/或RNA(转录成cDNA后)进行测序(DNAseq和RNAseq)。mNGS可在一个单一的测试中鉴定出几乎所有的病原体，包括病毒、细菌、真菌和寄生虫[3]，且可以识别罕见及新发现的病原体。此外，测序数据还可以间接用于其他的分析，例如通过RNAseq获取转录组基因数据来分析微生物特征和人类宿主反应。然而mNGS是大海捞针，因为只有小部分(通常小于1%)的测序读数是非人类的，且其中只有小部分可能与潜在的病原体相对应。因此，该方法的敏感性依赖于背景菌群水平。TAS具有增加测序数据中病原菌序列数和比例的优点。靶向测序是使用高度保守的引物进行一般PCR扩增，然后从临床样本中检测与特定类型相对应的所有微生物，如：用于检测细菌的16S核糖体RNA的基因扩增，以及用于检测真菌的18S核糖体RNA和内转录间隔区(ITS)的基因扩增。靶向NGS方法的另一个例子是设计横跨基因组的引物，促进PCR扩增，以便直接从临床样本中获得病毒基因组[4]。已有许多医院已经将该技术引用到临床样本检测中，从而增加了感染性疾病诊断的数量和比例[5]。mNGS是对样本中所有基因组进行测序，具有广覆盖优势，可以识别病毒、细菌、真菌、寄生虫、少见及新的病原体，并且它可以扩展微生物种群的特征，包括亚型、抗生素耐药性和致病基因的携带。TAS是针对特定微生物种群进行检测，相较于宏基因组测序，其测序深度较深、花费相对较低，但它无法分类到具体物种，且受到检测范围的限制(如只能检测细菌或真菌，甚至仅检测分枝杆菌)以及需要对检测样本有预先判断。随着NGS和生物信息学的日益普及，宏基因组技术作为一种新型的感染性疾病诊断方法正逐步得到应用。

2 下呼吸道存在的正常菌群

目前人们认为健康人的下呼吸道由多种微生物组成的动态稳定的生态系统，这些微生物也包括潜在的致病菌。下呼吸道微生物主要来源于口咽部的微吸入、周围空气的吸入及黏膜表面的直接弥散。肺部微生物组接近于口腔微生物组，但又存在不同：口腔微吸入在夜间达到顶峰，在白天逐渐减弱，移入速度减慢，清除作用增强。这种昼夜变化导致了肺部微生物组与口腔微生物组的不同。呼吸道微生物组在早期生命中是动态发展的，与出生方式、喂养方式、抗生素使用、生存环境等有关[6]。健康人肺内存在氧分压、PH值、温度等生理参数细微区域变化，但目前研究并未发现健康人肺内微生物存在明显的差异[7]。Morris等人对美国8个城市的健康受试者的肺微生物组的分析研究表明[8]，在吸烟者和不吸烟者的口腔中，卟啉单胞菌属Porphyromonas、奈瑟菌属Neisseria及孪生菌属Gemella等菌群存在差异，但下呼吸道菌群中没有明显差异，并且没有发现明显地域差距。Hilty及Molyneaux等人对英国健康人肺部微生物的研究表明，其中检测到的最丰富的微生物与美国健康受试者相似[9]。综上所述，虽然健康人肺部菌群受多种因素的影响具有个体差异，但是在总体上具有相同的特点。在健康人的下呼吸道广泛存在着多种细菌，包括拟杆菌门Bacteroidetes、厚壁菌门Firmicutes、变形菌门Proteobacteria、梭杆菌门Fusobacteria、放线菌门Actinobacteria，其中以拟杆菌门(普氏菌属Prevotella)及厚壁菌门(韦荣氏球菌属Veillonella、链球菌属Streptococcus)为主[8]。有研究者发现，相比于口腔，Tropherymawhipplei在肺中相对富集[7-8]。对于健康人肺部真菌组及病毒组微生物的相关研究较少，在健康人的肺内发现的真菌组最常见的是Davidiellaceae科，枝孢菌属Cladosporium、散囊菌属Eurotium、青霉属Penicillium、曲霉菌属Aspergillus、念珠菌属Candida、新萨托菌属Neosartorya、马拉色霉菌属Malassezia、丝齿菌属Hyphodontia、克鲁维酵母属Kluyveromyces和肺囊虫属Pneumocystis等[10]。健康人肺部真菌组的个体差异较大，即使罹患同一种疾病，不同患病个体的真菌群落有较大差别。对健康人肺部病毒组的研究表明主要以噬菌体及Anelloviridae家族成员为主[11]。

3 在下呼吸道感染诊断中的应用

随着二代测序技术的发展，人们逐渐发现健康人“无菌的肺部”也存在多种微生物，若肺部微生物多样性降低或部分微生物丰度异常增高，会打破了微生物的动态平衡及免疫稳态而导致肺炎发生[12]。近些年来NGS应用于肺部疾病的研究也越来越广泛，包括肺囊性纤维化、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、下呼吸道感染等，其中mNGS应用于下呼吸道感染显示出巨大优势。胡必杰等人[13]对成人感染性疾病样本同时进行的mNGS与传统培养检测，回顾性诊断为感染性疾病有347例，其中有255例(73.5%)诊断为下呼吸道感染。研究发现：mNGS诊断感染性疾病的敏感性优于传统培养检测方法(50.7% vs 35.2%；P<0.01)，而特异性无明显差异(85.7% vs 89.1%；P=0.39)；对于结核分枝杆菌、病毒、厌氧菌及真菌微生物的诊断价值优于传统培养；此外，mNGS较少受以往接触抗生素的影响。联合采用针对DNA和RNA的检测手段(DNAseq与RNAseq)，Langelier等人[14]采用该方法对气道样本病原菌的确定具有更高的敏感度与特异度(100%和87.5%)，且RNAseq在78%的已鉴定微生物中产生了更丰富的序列，平均每个微生物的读数是DNAseq的2.2倍，说明RNAseq在发现潜在致病微生物方面可能更具有优势。针对儿童下呼吸道感染诊断价值的研究，Farnaes等人[15]对15名诊断为社区获得性肺炎儿童进行了游离血浆测序，与传统检测方法相比，mNGS具有较高的敏感性(86% vs 47%)，而且，在这15名儿童中，有7名因mNGS结果改变了抗生素治疗方案。说明mNGS亦可以提高儿童下呼吸道感染病原菌的检出率，有利于精准诊疗的临床实施。对于免疫缺陷患者下呼吸道感染的研究，Zinter等人[16]对34名免疫缺陷儿童的下呼吸道标本进行mNGS，结果在以前临床诊断呈阴性的样本中，有一半检测出了潜在病原菌，因此，mNGS对于呼吸道病原体检测敏感性大大提高。Leo等人[17]对一名白血病造血干细胞移植后出现肺部感染的成人患者的肺泡灌洗液进行mNGS，结果发现该技术可显著提高对细菌和真菌的检出率，并且可以识别出常规检测方法不能检测到的厌氧菌和病毒。除此之外，有研究进一步发现mNGS可更早更准确地发现成人肺移植后免疫缺陷患者病毒的检出率，对于特殊人群下呼吸道感染病原学确定意义重大，不仅可以早期实施精准治疗，还能改善免疫缺陷患者的临床预后。

除了上述呼吸道标本，李荷兰等[18]对20例肺组织标本进行了mNGS，其中有15例被mNGS成功鉴别出感染性病原菌。相对于组织病理学方法，mNGS对结核分枝杆菌复合群、真菌具有较高的敏感度与特异度(100%和90%；94.1%和100%)。相对于培养方法，mNGS对细菌和真菌阴性预测值较高(100%和72.7%)；但同时发现其阳性预测值偏低(细菌42.9%，真菌44.4%)，这可能与肺活检组织增加了人源序列的干扰、样本量小及测序深度有关。因此，我们也需注意mNGS报告解读时需要综合考虑标本中人源序列的影响、紧密结合临床及背景菌群信息等。

综上所述，临床应用mNGS可显著提高肺部感染病原学诊断的敏感性，加强人们对罕见及新发现病原菌的认识。在病因不明、抗生素暴露、免疫缺陷等患者的病原学诊断中具有更高的指导意义，为精准诊疗带来了希望。但是人们也发现一些存在的问题，比如：难以排除人源序列的干扰、外源微生物污染、DNA/RNA流程不能合并检测、未优化的检测流程对检测周期的影响、测序价格昂贵等问题一定程度上影响或限制了mNGS在临床疾病中的应用。例如，相对于无细胞体液，组织来源的样本增加了背景菌群，导致微生物测序读数的数量和比例减少，从而降低了mNGS的敏感性[19]。

4 未来临床应用及研究热点展望

目前将mNGS应用于临床感染性疾病诊断的研究越来越多，其中该技术在呼吸道疾病中的研究成为新近的研究热点。新型技术为克服mNGS的检测时效性的技术瓶颈带来希望，比如Charalampous等新开发的针对细菌性下呼吸道感染的纳米孔测序[20]可以高效移除宿主DNA，并在6h内准确识别病原体和抗生素抗性基因。除此之外，宏基因组未来发展还需关注以下几个研究方向：利用RNAseq检测宿主转录组评估临床感染相关性、检测微生物耐药基因和毒力因子、DNAseq与RNAseq流程合并等。相信不久的将来，随着宏基因组技术在临床感染性疾病应用中的不断深入与发展，形成一系列规范操作流程及解读标准，mNGS将会成为被广泛普及的一种病原菌检测方式，指导临床医师优化调整抗菌药物，助力解决抗感染治疗领域的世界性难题。