3类转基因南林895杨田间试验的安全性评估*

孙伟博 魏朝琼 马晓星 魏 辉 诸葛强

(南京林业大学生物与环境学院 南京 210037)

随着基因工程研究的不断发展，转基因技术被越来越多地用于植物遗传改良。相对于传统育种，转基因技术能够将特定的外源基因整合到受体植物中，打破了物种间隔离，可以更快更准确地对植物性状进行改良。从1983年首例转基因烟草(Nicotianatabacum)获得成功，1996年转基因作物商业化获得批准以来，全球转基因植物及其产品的商业化应用呈逐年增长的趋势(Halford，2018)，转基因农作物及转基因林木提高了相关的经济效益同时也具有重要的科研价值，但在另一方面，关于转基因安全性的问题一直争议不断。其问题主要来源于3个方面：1)转化基因对于人或动物等的潜在危害，由于少数转化基因编码的蛋白具有过敏性或毒性，人或动物食用后可能造成伤害(Pengetal.，2019)，另外在转基因过程中携带的抗性标记基因进入植物基因组可能会使人或动物产生抗药性；2)基因逃逸引发的环境危害，包括转基因植物与周边环境中的近源物种会由于花粉杂交等原因出现基因漂移，导致抗除草剂等基因进入其他物种基因组从而形成超级杂草(Wangetal.，2018)，还有基因漂移可能导致外源基因进入土壤微生物基因组中，对土壤微生物的生存及群落结构造成影响(Luetal.，2018)；3)对于生态多样性的不利影响，转基因植株的各种性状优势会使自身形成优势种群，抑制野生种群的发展从而对生态多样性造成破坏(贾士荣等，2014)，外源基因编码蛋白也可能通过转基因植物残体或根系代谢影响土壤微生物生长，从而破坏土壤微生物群落多样性(Weietal.，2018)。

面对转基因植物可能存在的风险，需要建立科学的安全评估体系。评估转基因植物的安全性问题应该从物种、基因和环境3方面统筹衡量，作为安全评估框架的一部分，转基因植物的大田试验成为转基因物种与现存物种比对的关键方法，也是目前国际上对于转基因安全评测原则达成的共识(Andersonetal.，2018)。本研究采用了3类转基因杨树(Populus)进行大田试验，分别是转类甜蛋白编码基因(PeTLP)的抗病系列、转Bt毒蛋白编码基因(Cry1Ac)的抗虫系列、转AtGols基因的耐旱和耐盐碱系列。3种基因均通过根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)侵染南林895杨(Populusdeltoides×P.euramericana‘Nanlin 895’)叶盘进行转化。其中，PeTLP基因来源于毛果杨(Populustrichocarpa)，编码的类甜蛋白对于多种病原菌具有抑制作用(Wangetal.，2013)；Cry1Ac基因为优化过的Bt毒蛋白编码基因，来源于苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)，其编码产物对美国白蛾(Hyphantriacunea)具有良好的灭杀性(张雁等，2012)；AtGols基因来源于拟南芥(Arabidopsisthaliana)，编码生成的蛋白激酶在植物抗旱、抗盐碱等多种生理进程中发挥着重要作用(Laetal.，2017)。通过比较不同转基因南林895杨对周围环境影响的横向差异以及各转基因株系自身相关参数的纵向差异，揭示不同外源基因、不同转基因株系和环境因素等对于转基因安全评估的影响，为转基因林木的安全评估及田间释放提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为3类转基因南林895杨，即转类甜蛋白编码基因(PeTLP)的TLP抗病系列(TLP1-2、TLP1-6、TLP1-7、TLP2-9、TLP2-11)，转Bt毒蛋白编码基因(Cry1Ac)的Bt抗虫系列(A1-3、A3-4、A4-6、A5-0、A5-23)，转AtGols基因的Gols抗逆系列(Gols2-1、Gols2-2、Gols2-3)。3类转基因南林895杨均采用植物表达载体pGWB9，通过农杆菌(LBA4404)侵染叶盘法进行转化获得。筛选阳性植株，于温室培养1年，剪取茎段在试验田中进行扦插种植。对照均为未转基因南林895杨。

1.2 试验田间设计

试验地位于江苏省宿迁市泗洪陈圩林场，该试验地为国家林业局已批准的转基因杨树田间试验林地。试验地地形平坦，周边土质、气温、降水等环境条件稳定一致。实际种植面积为97 m(南北)× 45 m(东西)，试验地北边为2 m宽排水沟和3 m宽道路，南边为空置地，东边为3 m宽排水沟，西边为3 m宽道路。3类转基因南林895杨及对照组均采用茎段进行扦插，定植方式依据苗木数量采用随机区设计和裂区设计，具体定植如图1所示，株行距为2 m × 2.15 m，不同转基因品系之间种植非转基因南林895杨进行隔离。试验地边缘种植南林895杨进行隔离，外围栽植不飘絮杨树品种进行隔离。试验地于2017年3月进行造林，试验期间不施用化肥及农药。

图1 试验田定植示意Fig.1 Planting map of experimental fieldA1-3,A3-4,A4-6,A5-0,A5-23：转Bt毒蛋白编码基因(Cry1Ac)的Bt抗虫系列；TLP1-2,TLP1-6,TLP1-7,TLP2-9,TLP2-11：转类甜蛋白编码基因(PeTLP)的TLP抗病系列；Gols2-1,Gols2-2,Gols2-3：转AtGols基因的Gols抗逆系列；NL895：未转基因南林895杨。A1-3,A3-4,A4-6,A5-0,A5-23:Bt insect-resistant lines of transgenic Bt toxin protein coding gene (Cry1Ac);TLP1-2,TLP1-6,TLP1-7,TLP2-9,TLP2-11:TLP pathogen-resistant lines of transgenic thaumatin-like protein coding gene (PeTLP);Gols2-1,Gols2-2,Gols2-3:Gols stress-resistant lines of transgenic AtGols gene;NL895:Non-transgenic Nanlin895 poplars.

1.3 研究方法

1.3.1 试验地环境及转基因植株生长情况测定 试验地气温和降水量分别采用温度记录仪(Hoiki，日本)和降水量记录仪(Hoiki，日本)进行记录，于2017年3月至2018年11月，每2个月对仪器中的数据进行1次拷贝。植株高度采用米尺进行测量，每个季度测量2次，记录相关数据。

1.3.2 外源基因稳定性的分子检测 对不同外源基因在南林895杨中的遗传稳定性进行评估，转化基因的载体均采用35S启动子，因此使用35S启动子序列作为上游引物，目的基因的下游序列作为检测的下游引物(表1)，采用PCR方法针对不同外源基因进行检测。于2018年6月对每个转基因系列分别随机采摘生长良好的叶片作为重复样本，使用植物总RNA提取试剂盒(天根，北京)进行总RNA提取，并利用反转录试剂盒(Takara，日本)合成cDNA作为PCR检测的模板，反应条件如表1所示。

表1 转基因杨树检测的PCR引物和退火温度及扩增片段大小Tab.1 PCR primers,annealing temperature(Tm) and amplification fragment size for detection of transgenic poplar

1.3.3 外源基因向土壤微生物转移风险评估 每个转基因系列随机选取3份土壤样品进行土壤微生物总DNA提取，具体提取方法依据试剂盒说明书(FastDNA Spin kit for Soil，MP Biomedicals，美国)。以土壤微生物总DNA为模板，分别使用不同外源基因的特异引物(表2)进行PCR扩增检测。

表2 土壤微生物检测的PCR引物和退火温度及扩增片段大小Tab.2 PCR primers,annealing temperature(Tm) and amplification fragment size for detection of soil microorganisms

1.3.4 土壤微生物数量检测 以随机区设计或裂区设计中相邻4株同一株系的植株作为单个取样区的4个顶点，选取每个取样区西北顶点植株，在距其主干半径20 cm的取样区域内，随机选取一点采集10～20 cm深处土壤50 g作为样本。将采集的土壤样本置于50 mL离心管中，所有样品收集于冰盒内，4 ℃冰箱保存。

采用四环素-葡萄糖-酵母提取物培养基(OGYE)进行土壤样品中真菌的培养，对土壤样品中细菌及放线菌培养采用蛋白胨-胰蛋白胨-酵母提取物-葡萄糖培养基(PTYG)，具体培养基配制方法参照Yu等(2013)。

将同一株系杨树下采集的土壤样品混合均匀后，称取60 g平均分为2份，1份倒入三角瓶中，加入15 mmol·L-1无菌磷酸缓冲液(pH7.0)270 mL，置于水平摇床上震荡10 min。吸取0.1 mL土壤悬浮液，使用15 mmol·L-1无菌磷酸缓冲液稀释1 000倍，分别取0.1 mL稀释后土壤悬浮液均匀涂布于OGYE和PTYG培养基上，每个样品设置3次重复，在室温条件下进行暗培养。培养3天后统计OGYE培养基上真菌菌落数目(colony forming unit，CFU)，培养7天后统计PTYG培养基上菌落数目。统计完成后使用70%乙醇将PTYG培养基表面轻轻擦拭，仍然存在的菌落为放线菌，分别记录细菌和放线菌菌落数目。另外1份30 g土壤样品置于烘箱内，80 ℃过夜烘干，称量并记录其干质量。样品中微生物数量计算公式如下：微生物数量=菌落数目×土壤干质量×稀释倍数，最终以每g土壤(干质量)形成菌落数目的对数值(lgCFU·g-1DW)进行比较分析。

1.3.5 转基因杨树的化感作用 于2017年开始，定期采集各转基因系列及对照组南林895杨叶片，利用“三明治”方法模拟转基因杨树对于野生植物的化感作用(图2)，以评估转基因杨树可能对于野生植物的负面效应。将采集的杨树叶片于50 ℃条件下烘干24 h，取烘干的叶片样本置于六孔板(康宁，美国)下排3孔中，每孔50 mg同一株系的叶片组织(对照组放置相同处理的未转基因南林895杨叶片组织)；在每个孔内倒入5 mL低熔点琼脂(0.5%，W/V)，凝固后再重复倒入5 mL低熔点琼脂，待琼脂全部凝固后，每孔加入5粒莴苣(Lactucasativa)种子。在六孔板的上排3孔中均倒入10 mL低熔点琼脂，待琼脂全部凝固后，每孔加入5粒莴苣种子，作为负对照。将六孔板放入培养箱于25 ℃条件下暗培养72 h。取出六孔板置于-20 ℃冰箱10 h，之后将莴苣种子取出，测量其胚根及下胚轴长度，每孔中的测量值去除最大值与最小值后，取剩余3粒种子的平均值进行记录。

图2 转基因杨树的化感作用Fig.2 Allelopathy of transgenic poplars CK-：未放置杨树叶片的负对照；CK：未转基因南林895杨叶片；T：转基因杨树叶片。CK-:Negative control without poplar leaves;CK:Non-transgenic Nanlin895 poplar leaves;T:Transgenic poplar leaves.

1.4 数据分析

利用Excel软件记录试验数据并进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 试验地气象条件及转基因植株生长情况

试验地位于江苏省中部，属季风气候。根据温度和降水量记录结果(图3)可以发现，在2017年4月至2018年5月期间，试验地降水量具有明显的季节性变化，在5—11月期间降水量较大，最大降水量出现在2017年10月1日，为75.5 mm；在11月至次年4月之间降水量较小，较长时间内没有降水。气温变化符合当地气候特点，最高气温出现在2017年7月24日，达到39.7 ℃，最低气温出现在2018年1月12日，为-10.3 ℃。试验地气象条件较为稳定，未出现影响杨树生长的极端天气，降水量和气温在不同的季节具有显著差异性，能够作为土壤微生物群落结构变化的影响因素进行分析。

图3 试验地降水量及气温记录Fig.3 Precipitation and air temperature records in the experimental field

根据对照组和转基因南林895杨树高测量结果(图4)，可以发现在正常生长环境条件下，转基因南林895杨的生长趋势与对照组的生长趋势基本一致，在6—12月之间，生长速度较快，12月至次年3月期间植株生长缓慢。在3个采样时间点上，Bt系列和TLP系列转基因杨树的树高平均值均低于对照组，而Gols系列的转基因杨树树高平均值均高于对照组，但方差分析结果表明转基因南林895杨树高与各自对照组之间的差异未达到显著水平(P>0.05)。Bt系列的杨树树高高于TLP系列和Gols系列，推测与扦插时茎段的生长状态差异相关。

图4 转基因杨树树高测量结果Fig.4 The height measurement of the transgenic poplars不同小写字母表示数值在0.05水平上存在显著性差异。The different lowercase letters mean significant differences among values at 0.05 level.

2.2 外源基因稳定性及向土壤微生物转移情况

采用PCR方法对不同外源基因在转基因南林895杨中的遗传稳定性进行检测，在3个系列的转基因南林895杨叶片中，均扩增到转化基因的特异性目的片段(Bt系列1 977 bp，TLP系列890 bp，Glos系列1 131 bp)，且与各基因保存质粒的阳性对照扩增片段大小一致，在对照组南林895杨中均未扩增到目的片段(图5)，外源基因均稳定存在于各转基因系列南林895杨的基因组中。

对采集的土壤样品，提取微生物总DNA后使用细菌16SrRNA基因的特异引物进行PCR扩增检测(图6a-c)，所有样品均获得相同目的片段，表明所取土壤微生物样品均可用于基因转移检测。以质粒作为阳性对照，微生物总DNA作为检测模板，根据不同的转基因株系，利用特异性引物进行PCR检测(图6d-f)，结果表明仅在质粒当中扩增到目的片段，对照组及转基因组土壤微生物样品中均未检测到目的片段，未发现转基因南林895杨的外源基因向土壤微生物中产生转移现象。

图6 土壤微生物中16S rRNA基因及目的基因PCR检测Fig.6 PCR detection of 16S rRNA gene and target gene in soil microorganismsM：DNA ladder；P：质粒；C：对照组；1-5:各转基因株系的土壤样品。a-c：16S rRNA基因PCR结果；d-f：目的基因PCR结果。M:DNA ladder;P:Plasmid;C:Control group;1-5:Soil samples of transgenic lines.a-c:PCR results of 16S rRNA gene;d-f:PCR results of target gene.

2.3 转基因杨树对土壤微生物的影响

采用平板培养的方式对土壤微生物进行检测，以菌落形成数的对数作为衡量标准，分析转基因南林895杨对于土壤微生物生长的影响(图7)。在3个不同系列的转基因南林895杨种植区域内，其土壤微生物种类及数量变化趋势呈现一致性，真菌和放线菌菌落形成数的对数值(lgCFU·g-1DW)在1～4.5之间变动，总细菌菌落形成数的对数值(lgCFU·g-1DW)在3 ～7之间变动；不同月份间变化明显，在2017年7月微生物数量较多，在2017年12月具有明显的下降，经历大幅波动后在2018年4月微生物数量又恢复到较多水平。根据测定数据进行方差分析，结果表明在转基因杨树对土壤微生物影响方面，不同株系间差异性不显著，转基因组与对照组之间同样无显著性差异，仅不同取样时间的样品间存在显著性差异；结合气温及降水量结果(图3)，可以发现土壤微生物数量与气温和降水量变化关系密切，受其变化影响显著(P<0.05)，而转基因南林895杨对土壤微生物的群落结构和生长未产生显著影响。

图7 转基因杨树对土壤微生物的影响Fig.7 Effects of transgenic poplars on soil microorganisms

2.4 转基因杨树的化感作用分析

转基因植物的外源基因来源具有多样性，编码蛋白功能各异，因此分析转基因植物的化感作用对于转基因生物安全性分析必不可少。本研究采用“三明治”方法评估转基因南林895杨对于莴苣种子萌发生长的影响(Kikuchietal.，2009)。

根据对不同培养条件下莴苣种子胚根和下胚轴生长的测量结果(表3)及统计分析(表4)，可以发现：转基因南林895杨与正对照组(未转基因南林895杨)数据间无显著性差异，且不同转基因株系间数据不存在显著性差异，不同外源基因转化的叶片处理对于莴苣种子胚根和下胚轴的生长并无显著影响；有叶片组(转基因南林895杨和正对照未转基因南林895杨)与无叶片组(CK-)数据间存在显著性差异(P<0.05)，且转TLP系列南林895杨叶片对于胚根的萌发生长，不同月份样品处理所得数据具有显著性差异(P<0.05)，在另外2个转基因系列中数据无显著性差异，以上结果表明叶片的添加能够对莴苣种子的胚根和下胚轴生长产生显著影响，但外源基因对于莴苣种子胚根和下胚轴生长无显著影响。

表3 转基因杨树对莴苣种子生长的影响Tab.3 Effect of transgenic poplars on growth of lettuce seed

表 4 转基因杨树对莴苣种子生长影响的统计分析Tab.4 Statistical analysis of the effect of transgenic poplars on lettuce seed growth

3 讨论

自Fillatti等(1987)首次报道转基因杨树以来，转基因树木的环境释放在世界范围内引起广泛的争议，争议的焦点在于转基因树木的安全性，其中包括：外源基因在转基因植物体内的稳定性；基因漂移可使近源物种携带优势基因从而影响遗传多样性；外源基因的预期和非预期效应，其功能表达对于转基因树木自身生长的影响及对非目标生物的潜在威胁；对周围环境植物或微生物可能造成不利影响从而破坏环境生态；转基因树木花粉、花絮及可食部分等对于动物及人生命安全的危害(Gongetal.，2012；Kljujevetal.，2018)。

对转基因树木的安全性进行评估，需要分析外源基因在受体植物中的稳定性以及基因插入引起的表型变异。本研究采用载体35S启动子序列作为上游引物，以基因序列作为下游引物，对进入大田阶段1年时间的转基因南林895杨进行检测，结果表明3种目的基因仍稳定存在于转基因杨树基因组内。而外源基因的随机插入，在改变转基因树木预期性状的同时会产生非预期效应。转CpTI基因的三倍体毛白杨(Populustomentosa)回交杂种的3个转化株系中，有2个株系的树高及地径与未转基因植株无显著差异，另外1个株系的树高和地径显著优于未转基因植株(Zhangetal.，2002)；在杂交杨(Populusalba×P.berolinensis)中过表达乙烯效应因子的编码基因ERF，在无胁迫条件下，13个转基因株系的树高均显著高于未转基因杨树(Lietal.，2009)；在三倍体毛白杨中转入多拷贝rolB基因，1年后对其生长参数进行测定，结果表明转基因杨树树高均低于未转基因杨树且各株系间差异显著，rolB基因转入位置的不同，导致基因表达量不同，从而造成转基因植株之间的树高差异(张晓军等，2011)。本研究当中Bt系列和TLP系列转基因杨树的树高平均值均低于对照组，Gols系列的转基因杨树树高平均值均高于对照组，尽管存在生长差异，但方差分析表明转基因杨树树高与对照组之间并无显著性差异，3个外源基因的插入并未对南林895杨的树高产生显著影响。

土壤微生物是土壤生态系统稳定的重要支撑力，在土壤物质循环过程中发挥关键作用，是土壤生态环境稳定的重要表征。转基因树木种植大田后，其根系外泌物及外源基因可能会影响周围土壤环境中的微生物群落结构，同时在微生物降解和吸收有机物的过程中进入其体内(Figueredoetal.，2018)。例如转基因抗病植物可能会对非目标微生物多样性及动态性产生影响，同时抗性基因也可在水平转移上为细菌和真菌等土壤微生物提供选择性优势。本研究以外源基因序列作为引物对土壤微生物进行检测，结果表明外源基因未向环境微生物中产生转移现象。尽管不同月份间土壤中真菌、细菌及放线菌数量变化明显，但方差分析表明转基因组与对照组之间无显著性差异，群落结构变化受气温和降水影响显著，转基因杨树未对土壤微生物群落产生显著影响。相似的结果在转基因陆地棉(Gossypiumhirsutum)和玉米(Zeamays)对土壤微生物影响的研究中有所报道。转基因棉SGK321与非转基因亲本棉或常规棉根际土壤微生物种群在某些生育期和某些年份存在微小差异,主成分分析表明转基因棉SGK321与非转基因亲本棉根际土壤中细菌、真菌和放线菌的数量没有显著差异(Zhangetal.，2014)。转cry1Ab和epsps基因的玉米C0030.3.5根际土古细菌数量随生长期的推进呈现先升高后降低的变化趋势，但转基因玉米与对照组间古菌丰度及群落结构均无显著差异，古菌数量变化主要受生长时期影响(王晶等，2017)。

本研究所采用的试验材料为南林895杨，均为雌株，不产生花粉，因此不存在花粉飘散形成的基因安全问题。但转基因杨树由于外源功能基因的插入，可能会通过根系分泌物、叶片及其残体等影响环境中其他植物的生长(Aslametal.，2017)。本研究采用“三明治”法模拟转基因杨树的化感作用，评估转基因南林895杨对于莴苣种子生长的影响，该方法能够更直观地反映外源基因在受体植物中表达所产生的影响(Kikuchietal.，2009)，结果表明有叶片组与无叶片组(CK-)数据间差异显著(P<0.05)，叶片的存在能够显著影响莴苣种子的萌发生长，但不同外源基因的叶片间对于莴苣种子胚根和下胚轴的生长并无显著影响，同时转基因杨树与对照组之间无显著差异。尽管转TLP系列南林895杨不同月份叶片样品对莴苣种子生长影响的数据间具有显著差异性(P<0.05)，但转化基因并未显著影响莴苣种子生长，推测与采集叶片的生长状态有关。因此，3种外源基因对于莴苣种子胚根和下胚轴生长无显著影响。

4 结论

本研究以进入田间试验的3类(Bt、TLP和Gols)转基因南林895杨为研究对象，对其外源基因的稳定性、转基因杨树的生长、外源基因转移及对环境微生物和植物等影响进行了初步评估分析，表明3种外源基因仍然稳定存在于转基因南林895杨中，外源基因对转基因杨树生长未产生显著影响，3种外源基因没有发生基因转移现象，且未进入周围土壤微生物基因组中，外源基因的表达对于土壤微生物群落结构无显著影响，转基因南林895杨叶片无显著化感作用。综上所述，本研究中Bt系列、TLP系列和Gols系列3类转基因南林895杨在田间试验中无明显的环境危害。