基于细胞自噬探讨通督调神针法对缺血再灌注大鼠神经功能及Beclin-1蛋白表达的影响*

谷诗浓,刘毓佳,王振杰,黄赛娥

(1.福建中医药大学,福建 福州 350122; 2.福建省康复技术重点实验室,福建 福州 350122;3.福建中医药大学附属康复医院,福建 福州 350003)

脑血管疾病是世界公认的第三大致死性疾病，常具有高发病率、高致残率及高死亡率的临床特征，是属于中枢神经系统急性脑血流循环障碍性疾病范畴，亦是属于中医学“中风病”[1]。在此类发病人群中，缺血性脑卒中是主要发病类型，占87%[2]，现代大量基础、临床研究表明，中医针刺对此类疾病疗效明显，其机制可能与抑制炎性反应、抗氧化应激、抑制脑水肿形成、抑制细胞凋亡、促进神经和血管再生等相关，且早期介入疗效更佳，但具体作用机制尚不明确[3-6]。自噬(autophagy)作为一种细胞自我调节的降解途径，通过该途径，细胞质中的内含物被递送至溶酶体降解，形成自噬体，有清除已损伤的细胞器和异常折叠蛋白的功能。当机体发生缺血再灌注损伤时，会激发细胞自噬现象，但自噬现象的激活对机体是一把双刃剑，有研究表明适度激活自噬可促进细胞自体修复，从而减轻细胞损伤程度。因此，自噬现象在神经系统疾病中起着至关重要的作用[7-10]。本研究以“通督调神”针法作为干预手段，通过神经功能行为学评分、TTC染色法对干预前后脑梗死范围改善程度的分析，探讨“通督调神”电针法通过调节自噬蛋白Beclin-1进而对缺血再灌注损伤大鼠神经功能起到保护作用。

1 实验材料

1.1 实验动物

选购60只SPF级健康雄性SD大鼠，体质量(250±20)g，由上海斯莱克实验动物责任有限公司[许可证号：SCXK(沪)2012-003]提供，在福建中医药大学实验动物中心[许可证号：SYXK(闽)2013-005]分笼饲养并进行适应性喂养7 d，饲养条件:温度(23±1)℃，并对大鼠称体质量、编号。当大鼠体质量(280±10)g进行造模实验及干预。实验过程均严格按照国际动物保护和使用指南的规定操作。

1.2 主要试剂和仪器

2，3，5-三苯基氯化四氮唑(Sigma，USA)；线栓(广州佳灵生物技术有限公司)；G6805型电针仪(苏州医疗用品厂有限公司)；Beclin-1一抗(Cell Singaling Technology公司)；PMSF、BCA蛋白定量试剂盒、电泳胶配液、超敏ECL发光试剂盒(博士德生物有限公司)。

2 实验方法

2.1 动物分组

采用随机数字表法将60只SD大鼠分为空白组、假手术组、模型组各电针组各15只。

2.2 模型制备与筛选

大鼠体质量到达(280±10)g时术前禁食12 h。称重后，腹腔注射10%的水合氯醛3.3 mL/1 kg麻醉。模型组和电针组大鼠参照Zea-Longa线栓法制备并加以改进，制备大脑中动脉缺血再灌注模型。麻醉后，向一侧牵拉舌头避免窒息。酒精消毒并沿颈正中切口切开皮肤，长度约3～5 cm。充分分离、暴露出左侧颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉，注意避开其他血管以及神经。在颈总动脉结扎上方近心端剪开一处“V”型切口，从切口处向颈内动脉方向插入线栓，感觉线栓进入受阻时，打开血管夹让线栓进入，直至遇到轻微阻力，进入深度为18～20 mm。线栓成功进入后，封闭左侧大脑中动脉血流，观察2～5 min无出血、渗血情况后可进行缝合。待2 h后缓慢退出线栓至颈总动脉分叉处。实验过程和动物苏醒期间注意保温，假手术组只需分离血管后缝合，并不插入线栓。手术结束待动物苏醒2 h后参照Zea Longa神经行为学评分标准，对实验老鼠进行评分,判断手术是否成功。0分：提起鼠尾，可伸展双上肢，无神经缺损症状；1分：不能完全伸展对侧前爪；2分：提起鼠尾对侧前肢内旋，肩内收，行走时向对侧转圈；3分：行走时向对侧倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失。神经功能评分为1～3分的大鼠为造模成功，纳入实验，0分和4分者剔除。

2.3 选穴及干预方法

在动物苏醒评分后，选取造模成功大鼠进行适应性训练，抓至鼠板上固定、放置半小时，第2天进行电针干预。空白组、假手术组和模型组只进行同等条件抓取并不进行电针干预，电针组大鼠穴位解剖位置参考华兴邦等编著的《实验动物腧穴图谱》[11]，选取百会(顶骨正中)、大椎(第7颈椎与第1胸椎间，背部正中)、足三里(膝关节后外侧，在腓骨小头下约5 mm处)，使用0.5寸华佗牌针灸针，百会和大椎平刺，足三里斜刺[12]，进针2～5 mm，选择疏密波，频率1/20 Hz，电流强度1～3 mA，30 min/次，1次/d。选择每天上午固定时段进行电针，干预7 d后将实验动物处死、取材。

3 观察指标及方法

3.1 神经功能行为学评分

参照Zea Longa神经行为学评分标准，模型组与电针组模型制备完成后评分、记录，其余两组同等条件抓取、记录评分。电针组连续干预7 d，每次针刺结束2 h后评分、记录，其余3组同等条件抓取、记录评分。

3.2 三苯基氯化四氮唑染色(Triphenyl tetrazolium chloride,TTC)

从各组中随机分别抓取5只大鼠腹腔注射10%的水合氯醛3.3 mL/1 kg麻醉断头、冰上取脑，迅速将脑组织放置于-20 ℃冰箱，同时将冠状位脑模具放入-20℃冰箱内预冷。将鼠脑正置于冠状位脑模具中均匀切片，去除嗅球、小脑和低位脑干，每片厚度约2 mm，脑组织切片放入2%TTC溶液中，并于37℃恒温箱内避光孵育15 min，期间可以适当翻动脑组织切片便于染色。染色结束后用滤纸吸干表面液体，按顺序摆放、拍照。选择Image J软件分析计算脑梗死面积和大脑面积，计算脑缺血区体积比。

3.3 蛋白免疫印迹(Western Blot)

从各组中随机分别抓取3只大鼠腹腔注射10%的水合氯醛3.3 mL/1 kg麻醉、冰上取脑，分离取出缺血半暗带组织放入离心管中。

3.3.1 提取蛋白 对组织称重，加入裂解液，超声研磨后，14 000 rp离心5 min后取上清液分装保存;

3.3.2 电泳 将计算好的上样量加入10%分离胶和浓缩胶中电泳,分别设定20 V、10 min,60 V、30 min,100 V、60 min；

3.3.3 转膜 切取分子量对应的目标条带转膜至PVDF膜上,转膜成功后超纯水荡洗，将PVDF膜放入封闭液中2 h，随后TBST荡洗5 min；

3.3.4 抗体孵育 放入一抗孵育(Beclin-1 Rabbit Polyclonal Antibody,Mouse anti beta Actin Monoclonal antibody)4 ℃过夜。TBST洗3×5 min，放入二抗孵育(Peroxidase-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L)1 h。二抗孵育结束后，TBST洗膜3×10 min。PVDF膜滴ECL显影液1 min后曝光，保存全部图像。以GAPDH为内参，采用Image Lab软件分析计算蛋白灰度值。

3.4 统计学分析

4 结果

4.1 各组神经功能行为学评分比较

模型制备后，栓塞过重死亡3只，剔除后模型组13只、电针组14只，空白组与假手术组各15只。神经功能行为学评分显示：空白组与假手术组的神经功能评分均为0分；与空白组和假手术组比较，模型组与电针组的神经功能评分显著增高(P<0.05)；干预7 d后，与空白组和假手术组相对，模型组的神经功能评分显著增高(P<0.05);与模型组相比，电针组的神经功能评分显著降低(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠Zea-Longa神经功能行为学评分比较

4.2 各组TTC染色比较

使用TTC染色法对大鼠脑组织进行染色，以便确定脑组织梗死灶范围。大鼠脑组织TTC染色后的梗死灶会呈苍白色，而未梗死组织可被染成玫瑰红色，白色与红色之间界限清晰。与空白组和假手术组比较，模型组有明显梗死灶(P<0.05)；干预7 d后，电针组与模型比较，梗死灶显著减少(P<0.05)。见表2、图1。

4.3 各组Western Blot比较

Beclin-1蛋白灰度值的计算以GAPDH为内参，与空白组和假手术组比较，模型组Beclin-1表达水平增加(P<0.05)，干预7 d后，电针组与模型组比较Beclin-1表达水平进一步增加(P<0.05)。见表3、图2。

表2 各组大鼠脑梗死面积比比较

图1 各组大鼠脑梗死面积比较

表3 各组大鼠缺血半暗带皮层Beclin-1/GAPDH蛋白表达水平比较

图2 Western Blot法检测各组大鼠缺血半暗带皮层Beclin-1蛋白的表达

5 讨论

中医学认为脑卒中属于“中风”范畴，病机为阴阳失调、气血亏虚所致，治疗原则以调阴阳、补气血和通经络为主。《黄帝内经》对针刺治疗“中风”的辨证论治和取穴原则都有大量记载，并肯定针刺治疗和预后的疗效。督脉自古有“阳脉之海”“病变在脑，首取督脉”之说，亦有前期文献梳理证实“百会”在改善脑卒中后认知功能障碍针灸治疗中起到重要作用[13]，因此本研究遵循“通督调神”针法的选穴基本原则，择“百会”作为主穴[14-15]，同时为满足振发阳气的作用配伍“大椎”“足三里”电针干预，实验结果表明早期进行“通督调神”针法干预可明显改善脑缺血再灌注损伤大鼠神经行为学评分、脑梗死范围，并可能通过调控自噬相关蛋白Beclin-1表达水平，进而保护脑缺血再灌注损伤后大鼠脑神经功能。在Beclin-1( Beclin-1:autophagic regulator and therapeutic target in cance)众多生物学作用中，最主要的作用是调控自噬体膜的合成，它与许多自噬调控蛋白直接或间接结合形成蛋白复合体，进而调控自噬水平。在自噬初始阶段它与三类磷酸肌醇3-激酶(Class III phosphoi-nositide3-kinase,PI3K)、自噬相关基因-14(Autophagy associated gene-14,Atg14)形成三聚体，并不断募集胞浆中其他自噬相关蛋白，调控自噬前体和自噬体膜的形成，介导细胞自噬发生[16-19]。同时大多数缺血性脑卒中导致的神经系统性疾病伴有异常折叠蛋白和蛋白聚集体的累积，自噬则作为机体自我防御体系的关键调节机制之一，常在细胞缺血、缺氧情况下被应激激活，通过清除已损伤的细胞器和异常折叠蛋白的功能，从而维持神经细胞内环境稳态。因此 Beclin-1作为调控自噬水平的重要靶点，干预其表达水平，适当地激活自噬程度，对减轻脑缺血再灌注大鼠神经元细胞的损伤有重大意义。

综上所述，本研究在缺血再灌注的基础上进行电针干预，证实“通督调神”针法可降低脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能行为学评分，缓解脑神经功能缺损症状，有效减小脑梗死面积比，改善脑细胞凋亡情况。提示保护脑神经系统功能可能与促进自噬相关蛋白Beclin-1含量的表达、增加脑组织自噬水平有关，为临床治疗缺血性脑卒中提供更多思路，但电针如何具体调控神经细胞的机制不明，还需今后进一步的实验证明。