臭氧处理对丁香鱼干品质特性的影响

顾赛麒，胡彬超，杨晓霞，鲍嵘斌，郑志成，林招永，丁玉庭，柯志刚，张继磊

(1.宁海县浙工大科学技术研究院，浙江 宁海 315600；2. 浙江工业大学 食品科学与工程学院，浙江 杭州 310014；3. 国家远洋水产品加工技术研发分中心(杭州)，浙江 杭州 310014；4. 瑞安市华盛水产有限公司，浙江 瑞安 325200；5. 玉环市东海鱼仓现代渔业有限公司，浙江 玉环 317602)

丁香鱼为鳀鱼(Engraulisjaponicus)幼鱼的俗称，又称抽条、离水烂、小银鱼等，属温水性中上层鱼类，是一种广泛分布于西太平洋和西印度洋的亚热带鱼种[1]，我国东海海域是其重要产地之一。丁香鱼富含多种氨基酸、不饱和脂肪酸与微量元素，营养价值高。由于丁香鱼鱼体规格较小、内源酶活力高[2]，捕捞后一般直接在海上煮制后热风干燥加工成丁香鱼干(海蜒)，再通过冷链物流运输后销售，或二次加工成不同风味的食品销售。丁香鱼干成品的水分含量一般控制在35%左右，鱼体中含氮类物质含量也十分丰富。因此，若在物流、贮藏过程中温度控制不当，极易造成鱼干表面微生物大量增殖，进而引发食品安全问题。为保证丁香鱼干在流通、销售过程中的品质安全，通常需要在加工环节对其进行减菌处理。目前，常用的食品减菌方法有添加化学防腐剂、辐照及臭氧处理等[3]。前两种方法因分别具有化学物质残留、产生“辐射臭”等不足，越来越不被消费者接受认可。臭氧因其杀菌范围广、效果强、无任何残留等优点，受到越来越多的水产品加工企业的青睐[4]。

目前，臭氧在水产品加工领域的应用主要集中在新鲜水产品。多篇研究报道都显示臭氧可有效杀灭多种新鲜海水鱼和淡水鱼附着的多种腐败菌和致病菌，显著延长水产品货架期。与过氧化氢、次氯酸钠等杀菌剂相比，臭氧对水产品的负面影响小，更好地保持了鱼体的感官品质[5-6]。目前尚没有关于臭氧在鱼干制品中减菌、延长货架期等方面的报道。因此，本实验通过比较不同浓度的臭氧处理对丁香鱼干的菌落总数、TVB-N含量、脂肪氧化、色泽、微观结构和挥发性风味物质等指标的影响，旨在筛选出减菌效果好、对品质影响小的丁香鱼干臭氧处理工艺，以期为丁香鱼干生产企业提供相关借鉴方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

丁香鱼干：体长(4.0±0.8) cm，体重(0.3±0.1) g，水分质量分数(33.05±0.52)%，丁香鱼产自浙江东海海域，于2017年8月由温州市瑞安华盛水产公司提供。

石油醚、三氯甲烷、硫代硫酸钠(均为分析纯)等购自广东陇西化工有限公司；冰乙酸(分析纯)购自温州润华化工实业公司；碘化钾(分析纯)购自湖州化学试剂有限公司；平板计数琼脂(分析纯)购自青岛高科园海生物技术有限公司；酚酞(分析纯)购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

OHAUSAR2130电子天平，美国Adventurer公司；UV762紫外可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司；UltraScan色差仪，美国Hunter Lab公司；S4700场发射扫描电子显微镜，日本Hitachi公司；SY-M10臭氧发生器，徐州市声压臭氧设备公司；USafe系列便携式气体检测仪，山盾科技有限公司；7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪，美国Aglient公司；海能K9840自动凯氏定氮仪，济南海能仪器股份公司。

1.3 样品制备

将丁香鱼干充分混匀，等量分装成5 份，装入食品级保鲜袋中。调节臭氧发生器生成的臭氧质量浓度至250，500，1 000，1 500 mg/m3，流速为0.16 m3/h，依次在装有丁香鱼干的各保鲜袋中充入臭氧气体，充气时间30 min。以0.16 m3/h的流速充空气30 min作为对照。臭氧处理后的丁香鱼干真空包装后于25 ℃下贮藏6 d，每隔2 d取样进行指标检测。臭氧或空气处理的当天被定义为0 d。

1.4 实验方法

1.4.1 菌落总数的测定

参考GB 4789.2—2016《食品微生物学检验菌落总数测定》的方法。

1.4.2 挥发性盐基氮(TVB-N)的测定

参考GB 5009.228—2016《食品中挥发性盐基氮的测定》的方法。

1.4.3 硫代巴比妥酸反应物(TBARS)的测定

参考GB 5009.181—2016《食品中丙二醛的测定》的方法。

1.4.4 过氧化值(POV)的测定

参考GB 5009.227—2016《食品中过氧化值测定》的方法。

1.4.5 色差的测定

将一定量的丁香鱼干打碎，随机选择5 个点以上，采用色差仪直接测定样品的L*，a*和b*值，在此基础上计算各组样品以及其与原料丁香鱼间的总色差ΔE*=[(ΔL*)2+(Δa*)2+(Δb*)2]1/2。

1.4.6 微观结构的扫描电镜观察

丁香鱼干先经2.5%戊二醛溶液固定12 h，再用0.1 mol/L的磷酸钠缓冲液(pH 6.8)重复冲洗3 次，每次15 min，之后用60%，70%，80%，90%的乙醇各冲洗10 min，最后用100%的乙醇溶液重复冲洗3 次，每次10 min。待样品冲洗完毕后，将其置于洁净干燥的培养皿中，以冷冻干燥法除去样品水分。样品经钣金镀膜后，采用扫描电镜(Scanning electron microscope, SEM)观察其肌纤维形态特征，放大倍数为500倍，加速电压为15 kV。

1.4.7 挥发性风味物质的吸附萃取-气相-质谱(MMSE-GC-MS)鉴定

1) 萃取条件

参照顾赛麒等[7]的方法并稍作修改。准确称取4.0 g丁香鱼干，将其加入15 mL棕色顶空瓶中。选取4 个MTRCC18吸附子(空心圆柱体)，以固定装置串联后置于顶空瓶内样品正上方。将顶空瓶置于60 ℃恒温水浴锅中萃取1 h。待萃取完毕，取下所有吸附子并迅速装入热脱附管，再由前处理平台(MPS)将热脱附管转移至热脱附器(TDU)中进行热解析进样。

2) 仪器参数

TDU条件：不分流模式，初始温度40 ℃，以180 ℃/min升至240 ℃，保留6 min。CIS条件：液氮制冷，起始温度-40 ℃，平衡30 s，以12 ℃/s升至270 ℃，保留10 min。

GC条件：DB-5 MS毛细管柱(60 m×0.32 mm×1 μm)，汽化室温度240 ℃。起始柱温40 ℃，以4 ℃/min升至100 ℃，再以2 ℃/min升至150 ℃，最后以8 ℃/min升至240 ℃，保留5 min。载气为99.999%高纯氦气，载气流量1.0 mL/min。

MS条件：EI能量源，电子能量70 eV，质量扫描范围m/z35～450，离子源温度220 ℃，传输线温度250 ℃。

3) 定量方法

将10 μL质量浓度为10-5g/mL的内标物2,4,6-三甲基吡啶(TMP)加入4 g丁香鱼干样品中，通过计算待测挥发物与TMP峰面积的比值来求得各挥发物的浓度(绝对校正因子设定为1)，计算公式为

1.4.8 气味活性值分析

气味活性值(Odor activity value，OAV)反映了各挥发物对样品整体气味轮廓的贡献程度，OAV值≥1的化合物具有气味活性，可定义为气味活性物质[8]。计算公式为

式中：Ci为挥发物i的质量浓度，ng/g；OTi为气味阈值，ng/g。

1.4.9 感官评定

感官评定的评价员是影响感官评定结果的关键因素[9]。评定小组由15 位有感官评定经验的评价员组成(7 男8 女，平均年龄23 岁)，对丁香鱼干色泽、气味、滋味和组织形态进行综合评分，分为优、良、中、差和劣5 个等级，单项满分均为10 分。待单项评分结束后，每项得分乘以各自权重后求和，计算得到样品的感官总评分，感官评分标准[10-11]见表1。

表1 感官评分标准Table 1 Sensory evaluation criteria

1.4.10 数据分析

采用SPSS 17.0软件和Origin 8.0软件对数据进行处理分析，以单因素方差分析(One-way ANOVA)对数据进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同质量浓度臭氧处理对丁香鱼干菌落总数的影响

经不同质量浓度臭氧处理30 min的丁香鱼干在25 ℃下贮藏不同天数后的菌落总数见图1。经空气处理的对照组和经250 mg/cm3臭氧处理的处理组在贮藏0 d时的菌落总数分别为103.32，103.24CFU/g，经贮藏6 d后分别增加至107.43，107.46CFU/g。而经500，1 000，1 500 mg/m3臭氧处理的样品在贮藏0 d时的菌落总数分别为102.31，102.24，101.85CFU/g，经贮藏6 d后分别增加至106.54，106.40，106.19CFU/g。结果表明臭氧对丁香鱼干的减菌能力依赖于其质量浓度。250 mg/m3的臭氧没有明显的减菌作用，只有当其质量浓度增加至500 mg/m3或以上时才表现出明显的减菌效果。当臭氧质量浓度由250 mg/m3增加至500 mg/m3时，其减菌能力显著增强。当臭氧质量浓度继续增加至1 000 mg/m3和1 500 mg/m3时，其减菌能力没有或只有微弱增加。因此，可选择500 mg/m3的臭氧处理丁香鱼干。随着贮藏时间的延长，对照组和各处理组的菌落总数均增加，这主要是由于臭氧处理后的鱼干还有残留微生物，在充足的营养环境下继续生长繁殖。Da Silva等[12]利用臭氧气体处理固体培养基表面和竹荚鱼的5 种鱼体常见细菌时发现，低至270 mg/m3的臭氧即可达到有效的减菌作用。Nur等[13]用臭氧处理新鲜的罗非鱼片时发现，2 500 mg/m3的臭氧可显著减小鱼片中总微生物含量。这些工作都显示臭氧气体可显著杀灭鱼体附着的多种微生物，这也与本研究的结论一致。不同研究中有效臭氧浓度的差别可能是由于处理的样本不同和含有的微生物种类、含量的差异造成的。

图1 不同质量浓度臭氧处理的丁香鱼干菌落总数随贮藏时间的变化Fig.1 Effect of ozone concentration on colony count of dried Engraulis japonicas during storage

2.2 不同质量浓度臭氧处理对丁香鱼干TVB-N值的影响

TVB-N是微生物分解蛋白质产生的胺类以及挥发性氨等低级胺类化合物的总称[14]，常用于衡量动物性蛋白质的变质程度。不同质量浓度臭氧处理的丁香鱼干贮藏不同时间后的TVB-N值见图2。由图2可知：臭氧质量浓度对鱼干TVB-N的影响与其对鱼干菌落总数的影响基本一致。对照组和250 mg/m3臭氧处理组在贮藏0 d时的TVB-N值都为161.0 mg/kg，贮藏6 d均增加至238.1 mg/kg。两组样品在整个贮藏期内TVB-N值均没有明显差别，这表明此质量浓度的臭氧没有明显的杀灭微生物、抑制TVB-N生成的作用。若将臭氧质量浓度增加至500，1 000，1 500 mg/m3，处理后的鱼干在贮藏0 d时的TVB-N分别减小至153.5，152.6，151.5 mg/kg。高质量浓度臭氧(500 mg/m3及以上)在贮藏前期(0 d)鱼干TVB-N减小可能是由于臭氧与胺等发生氧化还原反应，导致后者被氧化生成硝基烷烃等物质[15]。在贮藏的前2天，高质量浓度臭氧(500 mg/m3及以上)处理组的TVB-N呈微弱增加，第2天以后快速增加，这可能是由于贮藏2 d以后，各处理组的微生物开始大量增殖。在不同贮藏期，鱼干的TVB-N值随着臭氧处理质量浓度的增加而减小，这是由于高质量浓度臭氧的灭菌作用更强，从而延缓了整个贮藏期内微生物降解蛋白质生成TVB-N。Nur等[13]用臭氧处理新鲜的罗非鱼片也发现500～1 500 mg/cm3的臭氧气体可明显抑制新鲜罗非鱼在贮藏期内TVB-N的生成。

图2 不同质量浓度臭氧处理的丁香鱼干TVB-N随贮藏时间的变化Fig.2 Effect of ozone concentration on TVB-N of dried Engraulis japonicas during storage

2.3 不同质量浓度臭氧处理对丁香鱼干POV值的影响

脂类作为一种氧化敏感型生物分子，尤其是海水鱼中常有的多不饱和脂肪酸，极易发生氧化，造成海产品风味和营养价值的降低。在臭氧等氧化剂存在下，脂类发生自氧化生成一级氧化产物——氢过氧化物，后者极易发生降解生成多种二级氧化产物，如醛、短链烃、醇、酯、酸、酮等[16-17]。因此，过氧化物值(POV)作为油脂和脂肪酸等脂类产生的初级氧化产物含量的指标，常用于表征鱼体脂肪氧化程度，其值越大表示鱼体内脂肪氧化越严重，鱼体品质也就越差。不同质量浓度臭氧处理的丁香鱼干在不同贮藏期内的POV值如图3所示。结果显示：不同质量浓度臭氧处理后的丁香鱼干POV值在贮藏0 d时比较接近。随着贮藏时间的增加，各处理组和对照组的POV值均逐渐上升。贮藏4 d或6 d后，各组POV值与处理的臭氧浓度呈明显的相关性。随着处理时臭氧质量浓度的增大，POV值也越大，这与颜明月等[18]在臭氧水对罗非鱼片脂质氧化及品质影响的研究中的结论基本一致，即臭氧有加速丁香鱼干油脂氧化的作用，且臭氧质量浓度越高氧化程度越严重。

图3 不同质量浓度臭氧处理的丁香鱼干POV随贮藏时间的变化Fig.3 Effect of ozone concentration on POV of dried Engraulis japonicas during storage

2.4 不同质量浓度臭氧处理对丁香鱼干TBARS值的影响

丙二醛作为一种常见且稳定的脂氧化二级产物，其含量也常被用于判定脂氧化程度[19]。在酸性条件下，丙二醛及其类似物随水蒸气蒸出与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成红色化合物，从而实现其含量的检测。常用TBARS(硫代巴比妥酸反应物)值代表丙二醛及其类似物含量。不同质量浓度臭氧处理的丁香鱼干的TBARS如图4所示。由图4可知：在贮藏初期，5 组丁香鱼干样品TBARS值差别较小。随着贮藏时间增加，TBARS值增加，表明丁香鱼干脂类二级氧化产物含量增加。在同一贮藏时间，各处理组的TBARS值均明显高于空气处理的对照组，且随着处理的臭氧质量浓度的升高，TBARS值也随之增大，这表明高质量浓度臭氧可引起更严重的脂氧化，这也与前述POV测定结果一致。顾卫瑞等[20]用850 mg/m3的臭氧处理草鱼片过程中也发现，在贮藏的前10天各处理组的TBARS值也显著高于未处理的对照组。

图4 不同质量浓度臭氧处理的丁香鱼干TBARS随贮藏时间的变化Fig.4 Effect of ozone concentration on TBARS of dried Engraulis japonicas during storage

2.5 不同质量浓度臭氧处理对丁香鱼干色差的影响

臭氧作为一种强氧化剂，在实际应用中常会改变原料的颜色。在色差分析中，L*值大小反映被测物的亮度，a*，b*值则作为发红和变黄程度的指标。b*值作为丁香鱼干的一个代表性指标，其大小意味着鱼干脂肪氧化程度的不同[21]。不同处理组的色差分析结果如表2所示。随着丁香鱼干贮藏时间的延长，其L*，a*，b*值均有显著性变化。其中，各处理组和对照组的b*值均随着贮藏时间的延长而增加，这表明脂肪氧化程度的加大。在不同贮藏期，b*值均随着处理的臭氧质量浓度的增加而显著增加，其趋势与前述2.3，2.4结果完全一致，这也证实臭氧引起了鱼干的脂肪氧化。在贮藏的前4天，处理组和对照组的L*值均没有明显变化，在贮藏6 d时，各组的L*值有微弱减小，这表明当贮藏一定时间后，丁香鱼干的亮度微有下降。各处理组和对照组在不同贮藏时期的L*值均没有明显差异，说明臭氧处理对丁香鱼干的亮度没有影响。各组的a*值也随着贮藏期的延长而增大，且随着臭氧处理质量浓度的增加，a*值增加更为显著，说明丁香鱼干由微绿逐渐褪色，向微红转变。随着贮藏时间增加，ΔE值逐渐上升。

表2 不同质量浓度臭氧处理后丁香鱼干色差的测定Table 2 Effect of ozone concentration on the color difference of dried Engraulis japonicas

2.6 不同质量浓度臭氧处理对丁香鱼微观结构的影响

SEM结果表明(图5)：空气处理的对照组的肌纤维纹理清晰，排列整齐，没有明显破坏裂隙，整体结构完整。常温贮藏6 d后，鱼体的肌纤维结构开始改变，表面出现裂隙，破坏程度加大。图(d～f)为不同质量浓度臭氧处理的鱼干贮藏6 d后SEM图像。随着处理的臭氧质量浓度的升高，鱼干表层裂隙显著增大，1 000，1 500 mg/m3臭氧处理的丁香鱼干的肌纤维及鱼体表层破坏尤其严重，其原因可能是臭氧引起的肌原纤维蛋白的氧化破坏了鱼体纤维结构的完整性。刘慈坤等[22]的研究也表明：臭氧处理会导致草鱼肌原纤维蛋白发生氧化，从而造成蛋白质构象的改变。

图5 不同质量浓度臭氧处理的丁香鱼干电镜图片Fig.5 SEM images of dried Engraulis japonicas in different ozone concentrations

2.7 丁香鱼干挥发性气味物质的MMSE-GC-MS测定

对经空气和不同质量浓度臭氧处理并常温贮藏6 d的丁香鱼干样品进行MMSE-GC-MS分析，共检测出6 大类29 种挥发性风味成分(表3)，主要以醛类、醇类、酮类以及芳香类为主，其中14 种化合物为5 种样品所共有，具体包括：5 种醛类(3-甲基丁醛、己醛、庚醛、苯甲醛和辛醛)，2 种醇类(1-戊烯-3-醇和1-戊醇)，3 种酮类(3-己酮、3-辛酮和2-壬酮)，2 种芳香类(甲苯和乙苯)，1 种烃类(十七烷)和1 种其他类(三甲胺)。计算各挥发物气味活性值(OAV值)后，可以从中进一步筛选出 8 种气味活性物质(OAV值>1)，具体包括：3-甲基丁醛、2-甲基丁醛、庚醛、辛醛、癸醛、1-辛烯-3-醇、2-辛烯-1-醇和2-乙基呋喃，其可能对丁香鱼干的整体气味具有重要贡献。进一步观察表3发现：除对照组(空气处理组)外，其余臭氧处理组样品的挥发物总质量浓度与气味活性值总和均随着臭氧质量浓度的增加而不断升高，表明经臭氧处理后，丁香鱼干样品整体挥发性风味发生了一定程度的改变，推测原因如下：1) 臭氧作为一种强氧化剂，加快脂质氧化反应速率，促使其进一步分解成小分子的醛、酮、醇类化合物；2) 臭氧的存在加速蛋白质或其他含氮物质的氧化分解。

表3 不同臭氧质量浓度处理的丁香鱼干样品挥发性风味物质分析表Table 3 Volatile flavor compounds identified in dried Engraulis japonicas with different ozone concentrations

醛类物质的阈值较低，对丁香鱼干整体气味贡献较大，其主要来源于不饱和脂肪酸的氧化分解[23]。由表3可知：醛类的OAV值占所有挥发物OAV总和的50%以上，远超其他类化合物。本研究中共有5 种醛类具有气味活性(包括3 种直链醛和2 种支链醛)，其中庚醛、辛醛和癸醛的气味特征多为青草味、水果香和油脂香，而3-甲基丁醛和2-甲基丁醛被报道具有果香金、巧克力香。随着臭氧质量浓度的不断升高，丁香鱼干中醛类物质浓度及OAV值显著增加，这可能是由于臭氧加速了丁香鱼干氧化程度，从而促进醛类物质生成。

醇类主要由脂肪酸氢过氧化物降解产生，或者来自醛酮类羰基化合物的还原作用[24]。饱和醇类化合物的阈值较高，而不饱和醇类化合物具有较低阈值[25]，对鱼类制品风味贡献程度显著。本研究中共检出3 种烯醇化合物，其中1-辛烯-3-醇和2-辛烯-1-醇具有气味活性，气味特征为蘑菇味和青草味，在腌金丝鱼等干制水产品中被报道检出[26]。

酮类主要由多不饱和脂肪酸的降解、醇类的氧化以及氨基酸的降解生成[24]，通常阈值较高，对样品整体风味贡献不大，有学者指出酮类对样品整体风味具有一定的修饰作用[27]。本研究共检出4 种酮类，其OAV值均小于1，不具有气味活性。

芳香类化合物主要来自于含苯环氨基酸的氧化降解或者从外部环境中迁入[28]。苯、甲苯等芳香类物质具有刺激性气味，它们可能是源自腌制时鱼肉中苯丙氨酸和酪氨酸等的降解。烃类一般阈值较高，对整体气味贡献不显著。Watanabe等[29]认为饱和烷烃类化合物主要来自于长链脂肪酸的键的裂解及其脱羧基作用，Selke等[30]认为它们是由氢过氧化物降解产生的烷基自由基生成的。

三甲胺一般来源于氧化三甲胺的还原反应，或含胆碱基团的卵磷脂的氧化分解[31]，被认为是水产品中具有典型腥臭味的挥发物。2-乙基呋喃属含氧杂环类化合物，具有类似可可豆的焦香气味，由硫胺素热降解产生，被报道是咸鱼的挥发性风味物之一[32]。

2.8 丁香鱼干感官评价结果分析

如表4所示，对照组色泽、气味、滋味和组织4 个指标的评价分数均为最高，各处理组的感官评价得分随臭氧质量浓度的升高而降低。250，500 mg/m3臭氧处理的丁香鱼样品的气味和滋味两项感官评价分数基本相同，在色泽和组织两项上250 mg/m3处理组略好。1 000，1 500 mg/m3处理组感官评价得分较低，尤其是1 500 mg/m3处理组在色泽和滋味两项上与对照组差距较大。综合脂氧化、色差、微观结构和感官评定等分析表明：臭氧质量浓度越高，处理的丁香鱼干在颜色、滋味等方面都会明显劣变，因此不宜选择过高质量浓度的臭氧用于丁香鱼干的加工处理。

表4 不同质量浓度臭氧对丁香鱼干的感官影响

3 结 论

通过对不同质量浓度(250，500，1 000，1 500 mg/m3)臭氧和空气处理的丁香鱼干的品质分析发现，500 mg/m3及以上质量浓度臭氧可显著抑制丁香鱼干常温贮藏过程中微生物增殖速率，减少TVB-N的生成量，而250 mg/m3臭氧处理效果不明显。各质量浓度臭氧均可引起丁香鱼干脂肪氧化指标(TBARS和POV值)、b*值、挥发性风味物质含量等增加，肌肉纤维断裂加重，感官评价得分降低等。因此，综合考量臭氧的减菌效果及其对品质的不利影响，优化选择500 mg/m3作为丁香鱼干最佳臭氧处理质量浓度，在实现有效减菌的同时可以尽量减小对样品原有品质的影响。