超声造影参数与分化型甲状腺癌肿瘤组织中增殖基因表达及淋巴结转移的关联性分析

王春梅， 王利利

(邢台医专第一附属医院/邢台市第一医院， 河北 邢台 054001 )

甲状腺结节为临床多发内分泌疾病，约4%～8%成年人通过触诊、40%成年人通过超声检查发现存在甲状腺结节，后期随访中约5%～6.5%甲状腺结节患者出现恶变[1,2]。甲状腺癌与其他恶性肿瘤相比恶性程度相对较低，确诊后早期手术治疗则预后理想，若明确良性可定期随诊。迄今为止，病理组织活检仍是国内外公认甲状腺结节病变诊断的“金标准”，但此诊断方式可重复性差，不便于动态监测病情进展，临床应用受限[3]。超声造影技术是当前新兴超声定量检查技术，可实时评价目标组织器官血流情况，已在腹腔实质性脏器相关疾病鉴别及辅助诊断中获得成功应用[4]。此外，肿瘤组织中增殖基因表达及淋巴结转移情况可客观反映病灶恶性程度及进展情况，是临床评价甲状腺结节癌变的常用辅助指标[5]。目前鲜见超声造影参数与上述生化指标间关系的研究，本研究对此进行了探讨，旨在为临床完善甲状腺结节癌变早期诊断及鉴别机制提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年10月～2019年12月期间的分化型甲状腺癌患者82例为恶性组，同期82例良性甲状腺结节患者为良性组。纳入标准：符合分化型甲状腺癌、甲状腺结节诊断标准[6,7]；均行手术切除；经病理诊断确诊；既往无甲状腺手术史；无大钙化灶或大片无回声区；患者、家属知情研究签署同意书。排除标准：伴其他组织器官原发恶性肿瘤者；合并全身或颈部感染性疾病者；伴严重肝肾心功能缺陷者。两组患者的年龄、性别、体质量指数、常规超声影像、病灶直径、病灶位置等基础资料均衡可比(P>0.05)，详见表1。

表1 两组患者一般资料对比

1.2 方法

1.2.1超声造影

仪器与试剂：彩色多普勒超声诊断仪(Philips iU22型)，探头频率8～12 Hz；对比脉冲序列呈现软件；注射用六氟化硫微泡造影剂(Bracco International B.V.)，使用向前冻干粉剂内加入5 mL生理盐水，振摇均匀。

检查方法：仰卧位，首先采用常规二维超声检查甲状腺，观察、记录病灶异常声像图特征，储存数据；切换造影模式，自肘静脉团注造影剂2.5 mL，随即迅速注射生理盐水5 mL，同时开始计时，观察病变及正常腺体灌注特征、增强差异，整个过程叮嘱患者勿吞咽。将数据存盘，用图像导入系统软件脱机分析，选取病灶和正常腺体作为感兴趣区，自动绘制造影时间-强度曲线，记录峰值强度(PI)、造影剂平均通过时间(MTT)、达峰时间(TTP)。

1.2.2增殖有关基因检测

术中取病灶标本，采取荧光定量PCR法测增殖有关分子mRNA表达，包括碱性螺旋-环-螺旋转录因子1(Twist1)、蛋白磷酸酶4调节亚基(PP4R1)、靶向Xklp2靶蛋白(TPX2)、程序性细胞死亡因子(PDCD4)，用计算机软件计算目标基因表达量。

1.3 观察指标

(1)对比两组病人的超声造影参数(PI、MTT、TTP)。(2)对比两组病人肿瘤组织标本中增殖有关基因(Twist1、TPX2、PP4R1、PDCD4 mRNA)表达情况。(3)对比不同PI、MTT、TTP水平的恶性组患者增殖有关基因表达情况。(4)分析分化型甲状腺癌患者超声造影参数与增殖有关基因表达的关系。(5)对比有/无淋巴结转移的恶性组患者超声造影参数。(6)分析分化型甲状腺癌患者超声造影参数与淋巴结转移的关系。(7)分析超声造影参数对分化型甲状腺癌患者淋巴结转移的预测价值。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 两组超声造影参数

恶性组患者的PI、MTT、TTP平均水平均低于良性组(P<0.05)。见表2。

表2 两组患者超声造影参数比较

2.2 两组患者肿瘤组织标本中增殖有关基因表达

恶性组患者肿瘤组织标本中Twist1和TPX2 mRNA表达量高于良性组，PP4R1和PDCD4 mRNA表达量低于良性组(P<0.05)。见表3。

表3 两组肿瘤组织标本中增殖有关基因表达比较

2.3 不同PI、MTT、TTP水平的恶性组患者增殖有关基因表达

将恶性组患者按照PI、MTT、TTP平均水平，分为高水平组和低水平组。PI、MTT、TTP低水平恶性组患者肿瘤组织标本中Twist1和TPX2的mRNA表达量高于高水平患者，PP4R1、PDCD4的mRNA表达量低于高水平患者(P<0.05)。见表4。

表4 不同PI、MTT、TTP水平恶性组患者增殖有关基因表达比较

2.4 分化型甲状腺癌患者超声造影参数与增殖有关基因表达关系

经Spearman相关性分析可知，分化型甲状腺癌患者超声造影参数的PI、MTT、TTP水平与肿瘤组织标本中Twist1和TPX2的mRNA表达量呈负相关，与PP4R1和PDCD4的mRNA表达量呈正相关(P<0.05)。见表5。

表5 分化型甲状腺癌患者的超声造影参数与增殖有关基因表达的关系

2.5 有/无淋巴结转移的恶性组患者的超声造影参数

有/淋巴结转移的恶性组患者PI、MTT、TTP平均水平低于无淋巴结转移患者(P<0.05)。见表6。

表6 有/无淋巴结转移的恶性组患者超声造影参数比较

2.6 分化型甲状腺癌患者的超声造影参数与淋巴结转移的关系

经Spearman相关性分析，分化型甲状腺癌患者超声造影参数水平与淋巴结转移均呈负相关(P<0.05)：rPI=-0.583，rMTT=-0.608，rTTP=-0.629。

2.7 ROC拟合曲线

绘制超声造影参数对分化型甲状腺癌患者淋巴结转移的预测ROC曲线(图1和图2)，发现PI、MTT、TTP联合预测分化型甲状腺癌患者淋巴结转移的AUC值高于单一指标预测。见表7。

表7 超声造影参数对分化型甲状腺癌患者淋巴结转移的预测ROC曲线

图1 超声造影参数预测分化型甲状腺癌患者淋巴结转移的ROC曲线 a. 单一指标预测； b. 联合预测ROC曲线

3 讨论

近年受饮食、生活作息方式改变等诸多因素影响，甲状腺癌发病率有升高及年轻化趋势[8]。目前甲状腺癌诊断方式主要是细针穿刺细胞学活检，其属有创检查且受取材部位影响，存在5%假阴性和5%假阳性[9]。

超声造影借助造影剂观察目标组织血流灌注情况以辅助诊断组织生理病理状态，此技术是继二维超声及彩色多普勒超声技术后的革命性飞跃。鉴于血流信号异常是肿瘤演变的主要病理生理特征，因此，多数学者提出将超声造影作为甲状腺结节鉴别诊断及随诊的必要辅助手段[10,11]。本研究发现，恶性组PI、MTT、TTP水平低于良性组(P<0.05)。恶变甲状腺结节新生血管多、功能不成熟，且呈杂乱非均匀性排列，但幼稚新生血管难以为生长迅速的恶性细胞供给充分的血氧，病灶组织呈缺血、缺氧状态，因此造影过程呈低增强甚至无增强情况，表现为PI值降低、TTP提前和MTT缩短[12]。上述结果证实，甲状腺癌超声造影参数与其生物学行为间存在内在关联，可为临床评价提供参考依据。

在分子及淋巴结生物学行为层面，甲状腺癌组织细胞增殖、侵袭源自促增殖基因过表达，因此，通过检测相关基因可反映甲状腺癌恶性程度。本研究显示，恶性组肿瘤组织标本中Twist1、TPX2的mRNA表达量高于良性组，PP4R1、PDCD4的mRNA表达量低于良性组(P<0.05)。PDCD4对甲状腺癌细胞增殖过程具有抑制作用，其表达降低可显著诱导恶性细胞增殖、延长恶性细胞生存周期[13]；PP4R1属重要抑癌基因，临床动物实验已证实，其在甲状腺癌组织内表达量显著低于癌旁正常组织[14]；TPX2主要参与细胞有丝分裂中纺锤体组装、形成过程，随恶性细胞染色体基因异常扩增，TPX2呈高表达[15]；Twist1已被证实在乳头状甲状腺癌组织内高表达，可通过调控上皮-间质转化过程影响淋巴结转移[16]。本研究发现，PI、MTT、TTP低水平的恶性组患者肿瘤组织标本中Twist1、TPX2的mRNA表达量高于高水平患者，PP4R1、PDCD4的mRNA表达量低于高水平患者(P<0.05)。究其原因可能是随甲状腺癌肿瘤增殖恶性程度不断增加，增殖基因表达失衡情况逐渐加重，而病灶结节内可能存在微小癌栓造成微血管腔狭窄或闭塞，同时因正常甲状腺组织血管丰富，恶性细胞不断浸润生长过程中会大量破坏正常血管结构，继而引起结节中血管分布少于附近正常甲状腺组织，表现为PI、MTT、TTP水平越低，细胞内Twist1、TPX2的mRNA表达越活跃[17]。

目前根治术是临床治疗甲状腺癌的主要手段，但部分患者因存在局部淋巴结转移，术后会致病情反复，因此术前准确评价淋巴结转移情况是确保手术效果的关键环节。本研究显示，有淋巴结转移患者PI、MTT、TTP水平低于无淋巴结转移患者，且与淋巴结转移呈负相关(P<0.05)。ROC曲线分析显示，PI、MTT、TTP联合预测分化型甲状腺癌患者淋巴结转移的AUC值为0.880，可为临床术前评价淋巴结转移情况提供参考依据。

综上可知，超声造影参数PI、MTT、TTP异常程度与增殖基因表达及淋巴结转移直接相关，超声造影检查可量化反映甲状腺癌肿瘤细胞增殖及侵袭活性。