褪黑素对顺铂诱导的小鼠睾丸支持细胞TM4损伤保护作用机制

邵 帅,江 梅,姜经航,曹玉平，王开秀，蔡丽丽，王婷婷，杜家成，王 洋，洪乐鹏，丁 涛

0 引 言

顺铂是临床最常用的抗癌药物之一。顺铂广泛用于治疗颈部、膀胱和子宫颈等部位的恶性肿瘤，通过与DNA结合来诱导细胞凋亡和抑制细胞生长[1]。顺铂具有显著的抗癌活性，但也有耳毒性、肾毒性、神经毒性、睾丸毒性等不良反应[2]。顺铂也广泛用于男性生殖系统肿瘤的治疗，提高治愈率的同时对男性生殖系统有明显毒副作用，能够导致生精细胞凋亡、精子损伤以及精子畸形等，从而影响男性生育力[3]。目前, 顺铂导致睾丸生殖毒性的机制尚不明确, 研究显示氧化应激在顺铂引起的睾丸损伤中发挥着重要的作用，顺铂能够破坏睾丸组织内抗氧化系统，导致脂质过氧化物丙二醛以及活性氧ROS表达升高，抑制抗氧化酶超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione Peroxidase,GPx)、还原性谷胱甘肽(glutathione，GSH)，从而导致精子损伤和凋亡[4]。因此，抗氧化应激能够保护顺铂诱导的睾丸毒性损伤。

褪黑素是由松果腺合成和分泌的神经内分泌激素, 具有调节昼夜节律、镇静镇痛、抗肿瘤、抗氧化和免疫调节等作用[5]。褪黑素是一种天然抗氧化剂，能够直接清除多种自由基并且可以激活多种抗氧化酶[6]；研究显示在双氯芬酸钠诱导的生殖毒性损伤中，褪黑素可以通过提高抗氧化酶SOD、总抗氧化能力(total antioxidant capacity,TAC)、过氧化氢酶(Catalase，CAT)，降低乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase ,LDH)、丙二醛、尿酸以及C反应蛋白(C-reactionprotein，CRP)的表达发挥保护作用[7]。此外，褪黑素受体存在人类精子中段上，而且褪黑素与精子活力、受精以及精子的活力和形态有关[8]。目前男性生殖毒副作用的研究主要集中在睾丸，Sertoli细胞，又称支持细胞，存在于睾丸生精上皮中, 其在精子发育有重要影响。Sertoli细胞形态和功能的改变以及深层次的分子学研究已成为男性生殖领域最关注的热点[9]。鉴于顺铂导致的睾丸毒性损伤以及褪黑素在精子中抗氧化保护作用，本研究主要研究褪黑素对顺铂诱导氧化损伤的保护作用以及可能的机制。

1 材料与方法

1.1材料TM4细胞由广州医科大学附属第三医院惠赠。DMEM/F12培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、0.25%胰蛋白酶均购于美国GIBCO公司，褪黑素购于美国Sigma公司，顺铂购于齐鲁制药有限公司，噻唑蓝(MTT)检测试剂盒购于Abcam公司，丙二醛、CAT、GSH以及SOD检测试剂盒均购于南京建成生物工程研究所，occludin、N-cadherin抗体均购自Santa Cruz公司，紧密连接蛋白1(ZO-1)、β-catenin 、Nrf2/ARE通路核因子E2相关因子2((NF-E2-related factor 2，Nrf2)、血红素加氧酶1(Heme oxygenase，HO-1)、醌氧化还原酶(Quinone dehydrogenase1，NQO1)抗体均购于Abcam公司，β-acting、HRP-山羊抗兔购于中杉金桥生物技术有限公司。

1.2方法

1.2.1 TM4细胞培养TM4细胞培养于含有10%胎牛血清和1%青霉素、链霉素的DMEM/F12培养液中，将细胞置于5% CO2、37 ℃的培养箱中进行培养生长，24 h进行换液，取对数生长期细胞进行传代和实验。

1.2.2细胞分组及处理将处于对数生长期且生长状态良好的TM4细胞用胰蛋白酶消化，以1×105/ mL接种于6孔板中进行培养，每孔加入2 mL培养液。将细胞分为对照组(给予等量等渗盐水)、顺铂组(添加 0.014 mg/mol的顺铂孵育24 h建立损伤模型)、顺铂+褪黑素组(顺铂处理前0.5 h添加1 mmol/L的褪黑素预处理)、褪黑素组(添加1 mmol/L的褪黑素孵育)。

1.2.3MTT检测细胞存活率将TM4细胞以1×104/100 μL接种于96孔板中，分组如上，按照1.2.2中的药物处理，每组6个重复。空白组只加培养液，96孔板周围一圈用灭菌PBS代替。培养24h后去除旧的培养液，并加入180 μL的新鲜培养液，再加入20 μL MTT溶液(5 μg/mL)，培养4 h后加入DMSO 150 μL振荡至蓝紫色结晶溶解，最后酶标仪检测A值。细胞存活率计算如下：

细胞存活率=1-(用药组平均A值-空白组平均A值)/(对照组平均A值-空白组平均A值)×100%

1.2.4丙二醛、SOD、GSH、SOD活性检测TM4细胞按1.2.2中以1×105/ mL接种于6孔板中培养和处理细胞后，0.25%胰蛋白酶消化处理后收集TM4细胞，将细胞洗涤后加入裂解液(含PMSF)重悬细胞，放在冰块上裂解15 min，离心机中按4 ℃，12 000 r/min 离心 10 min，然后收集EP管中离心后上清液。按照试剂盒说明书进行操作，检测丙二醛、SOD、GSH以及CAT的含量活性。

1.2.5Western blot检测相关蛋白表达TM4细胞按1.2.2中以1×105/ mL接种于6孔板中培养，处理细胞后提取细胞总蛋白，BCA试剂盒检测各组蛋白浓度，并调平各组蛋白浓度，各组取40 μg蛋白样品于聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后275 mA 电流2 h将蛋白转印至PVDF膜上，然后用5%脱脂奶粉封闭2 h后，PBST清洗后加入一抗ZO-1、Occludin、β-catenin、Nrf2、HO-1、NQO1(各抗体浓度均为1∶1000)，4 ℃冰箱孵育过夜；第2天恢复室温PBST清洗后，加入HRP-山羊抗兔抗体室温孵育2 h，PBST清洗后进行化学发光显影。

2 结 果

2.1褪黑素对顺铂诱导的TM4细胞增殖的影响MTT检测结果显示，与对照组比较，顺铂组能够明显抑制TM4细胞的增殖(P<0.01)；顺铂+褪黑素组明显改善顺铂对TM4细胞的抑制作用(P<0.01)。见图1。

2.2褪黑素对cDDP诱导的TM4细胞内抗氧化指标的影响活力检测结果显示，顺铂组丙二醛活力表达较对照组明显升高，较顺铂+褪黑素组明显降低，SOD、GSH、CAT活力表达较对照组、顺铂+褪黑素组明显下降(P<0.01)。褪黑素组SOD、CAT表达较对照组明显升高(P<0.05)。见表1。

与对照组比较,*P<0.01;与顺铂组比较,#P<0.01

表 1 褪黑素对顺铂诱导的TM4细胞内抗氧化指标的影响

2.3褪黑素对顺铂诱导的血睾屏障的影响Western blot结果显示，顺铂+褪黑素组、对照组ZO-1、Occludin 蛋白表达较顺铂组明显升高(P<0.01)，β-catenin蛋白较顺铂组明显降低(P<0.01)；顺铂+褪黑素组ZO-1、Occludin 蛋白表达较褪黑素组明显降低(P<0.01)。见图2，表1。

1:对照组; 2:顺铂组; 3:顺铂+褪黑素组; 4:褪黑素组

表 2 褪黑素对顺铂诱导的血睾屏障的影响

2.4褪黑素对顺铂诱导的Nrf2/ARE信号通路的影响Western blot结果显示，顺铂组中Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达较对照组明显下降(P<0.01)；顺铂+褪黑素组Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达较顺铂组明显升高(P<0.01)，HO-1、NQO1表达较褪黑素组明显降低(P<0.01)。见图3，表3。

1:对照组; 2:顺铂组; 3:顺铂+褪黑素组; 4:褪黑素组

表 3 褪黑素对Nrf2/ARE信号通路的影响

3 讨 论

顺铂作为临床抗肿瘤的一线用药，不管是用于生殖系统肿瘤，还是应用于肺癌、胃癌、食管癌等肿瘤，都会直接或者间接的导致睾丸毒性[10-12]。研究显示氧化应激损伤是顺铂诱导的睾丸损伤的重要机制，在顺铂诱导的大鼠睾丸损伤模型中MDA、8-OHdG和MPO水平升高，而抗氧化酶GSH 和SOD水平降低，导致精子数量、增殖指数减少，输精管萎缩、细胞间紧密连接功能退化[13]。主要由于顺铂引起睾丸组织内氧化和抗氧化系统失衡，抗氧化能力减弱产生大量的ROS，大量的ROS使生精细胞与精原干细胞大量凋亡,、曲细精管空隙扩大，影响精子发生最终导致精子的数量与质量的降低, 并影响雄性正常生育功能[14]。褪黑素作为一种新型高效抗氧化剂和自由基清除剂，能保护细胞核DNA、膜脂质等分子免受氧化损伤，并且与男性生殖系统以及精子保护有着重要的作用[15]。鉴于此，本研究以小鼠睾丸支持细胞TM4为研究对象，H2O2刺激TM4细胞诱导氧化应激损伤模型，探讨褪黑素发挥抗氧化保护作用以及可能机制。

本研究结果显示，顺铂诱导能够降低细胞存活率，这与杜月梅等[16]研究显示顺铂诱导小鼠睾丸支持细胞TM4细胞凋亡的结果一致。在顺铂诱导的损伤模型中脂质过氧化物MDA明显升高，抗氧化酶SOD、GSH、CAT表达明显下降，说明顺铂在诱导支持细胞损伤中产生氧化应激，导致氧化与抗氧化之间平衡失调，产生高反应醛类物质，这些亲电物质能够使参与精子生物能量通路以及运动装置结构和信号元件的蛋白质失调，从而对精子运动产生不利的影响，这些损伤与氧化性DNA损伤密切相关[17]；而褪黑素能够抑制顺铂的毒副作用，促进细胞存活率发挥保护作用，褪黑素能够发挥抗氧化作用，促进抗氧化酶SOD、GSH、CAT的表达，降低MDA表达，抑制顺铂诱导的氧化损伤作用；而Li等[18]研究也发现褪黑素可以通过MAPK-ERK信号通路保护心肌细胞免受氧化应激诱导的凋亡，说明褪黑素可以通过抗氧化发挥TM4细胞保护作用，这与抗氧化剂维生素C通过减轻氧化应激，诱导HSP在MT4细胞上表达减轻热损伤效应相一致[19]。睾丸中生精小管和血液之间存在着血睾屏障，它是支持细胞之间的紧密连接、缝隙连接、粘附连接以及桥粒组成，血睾屏障不仅为生殖细胞发育和运动创造了有利的微环境，而且还创建了一个免疫屏障, 确保免疫系统不能识别存在于生殖细胞表面的特异性抗原[20]，因此，血睾屏障在精子发生、形成和成熟过程中发挥着至关重要的作用，而顺铂诱导的氧化应激是否会损伤血睾屏障尚不可知，通过Western Blot结果显示睾丸中紧密连接蛋白ZO-1和occludin表达降低，睾丸中粘附连接蛋白β-catenin表达升高，而Liu等[21]研究也显示PM2.5通过TGF-β3/p38 MAPK以及减少睾酮分泌、睾丸紧密连接蛋白Occludin, Claudin-11表达降低导致血睾屏障损伤的结果一致；DEHP暴露能够损伤血睾屏障导致睾丸组织中粘附连接蛋白N-cadherin和β-catenin的表达增加；说明顺铂诱导的睾丸毒性对血睾屏障有明显的损伤作用，其机制可能与氧化应激有关[22]。然而顺铂诱导的氧化应激损伤仍不明确，研究显示二甲双胍在脊髓损伤后神经再生中的作用可能与抑制akt介导的Nrf2/ARE通路调控的氧化应激和线粒体功能障碍有关[23]；姜黄素类似物A13通过激活Nrf2/ARE通路缓解氧化应激，改善高脂饮食和链脲霉素诱导的糖尿病大鼠心肌纤维化[24]。因此，我门猜想褪黑素发挥抗氧化保护作用是否与Nrf2/ARE通路信号通路有关。本研究结果显示顺铂组中Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达明显下降，而添加褪黑素褪黑素能明显改善顺铂对Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达抑制作用，促进其蛋白表达；说明褪黑素发挥抗氧化保护作用与Nrf2/ARE信号通路有关。

综上所述，本研究发现褪黑素在顺铂诱导的损伤模型中抑制氧化应激，发挥抗氧化以及血睾屏障保护作用，促进细胞的存活，其可能的机制与Nrf2/ARE信号通路有关，但具体机制有待深入研究。