Prospero相关同源异形盒蛋白1在非小细胞肺癌中的表达及意义

杨 光，张 昆，王 俊

1.淄博市第一医院心胸外科，山东 淄博 255200；2.中国人民解放军济南军区总医院肿瘤科，山东 济南250031

肺癌是全世界癌症相关死亡的主要原因之一［1］。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）约占全部肺癌的80%。尽管近年来针对肺癌的手术治疗、放疗和化疗已取得了长足进步，但是患者5年生存率仍不足15%［2］。寻找肺癌潜在的分子生物学标志物是近年来研究的热点。Prospero相关同源异形盒蛋白1（prospero-related homeobox 1，PROX1）是一种高度保守的转录调节因子，其基因位于染色体1q32.2～32.3上，对淋巴管的形成和发育起到重要作用［3］。既往研究［4-6］发现，PROX1在乳腺癌、甲状腺癌和胶质瘤组织中高表达，并且与肿瘤细胞增殖、分化、侵袭、迁移和凋亡等密切相关。Zhu等［7］发现，PROX1在小细胞肺癌细胞中高表达，敲低PROX1基因后癌细胞增殖能力明显受到抑制。PROX1在NSCLC中的表达水平及意义既往少有报道。本研究用免疫组织化学法检测了NSCLC组织中PROX1的表达，探讨PROX1与临床病理学特征和预后的关系。此外，本研究通过下调PROX1的表达观察NSCLC细胞增殖、侵袭和迁移的变化，以期寻找潜在的NSCLC生物学标志物。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试剂和仪器

DF-12培养基、胎牛血清和胰蛋白酶均购自上海泽叶生物科技有限公司，Tris/EDTA修复液购自北京盛科博源生物科技有限公司，SP免疫组织化学试剂盒购自上海研卉生物科技有限公司，鼠抗人PROX1单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG、β-actin单克隆抗体购自美国Sigma公司，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量检测试剂盒和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝胶快速制备试剂盒均购自宝生物工程（大连）有限公司，LipoFiterTM脂质体转染试剂购自汉恒生物科技（上海）有限公司，PROX1 si-RNA由上海吉马制药有限公司合成并提供，细胞计数试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8）和transwell小室购自北京智杰方远科技有限公司。CO2培养箱购自美国Thermo公司，CX41型光学显微镜购自日本Olympus公司，超灵敏化学发光成像仪购自美国GE公司，微孔板阅读器购自德国耶拿分析仪器股份公司。

1.1.2 细胞

人NSCLC细胞系A549、H460、H1229和H358，人支气管上皮细胞Beas-2b均购自中国科学院典藏培养物保藏委员会细胞库/中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL链霉素的DF-12培养基进行培养，培养条件为37 ℃、CO2体积分数为5%，每3 d换液1次，当细胞融合度达80%时进行传代。

1.1.3 组织样本

选取2011年1月—2013年6月在淄博市第一医院进行择期手术治疗且资料完整的NSCLC患者86例，术前均未接受放化疗或免疫治疗，术后经病理学检查证实为NSCLC。86例患者中男性50例，女性36例；年龄46～68岁，平均（57.98±9.04）岁；TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期37例，Ⅰ～Ⅱ期49例；肿瘤直径≥3 cm者55例，＜3 cm者31例；吸烟45例；腺癌48例，鳞癌38例；出现淋巴结转移38例、远处转移12例。术中留取癌组织及配对的癌旁组织（距离癌组织≥5 cm［8］），组织石蜡标本均由淄博市第一医院病理科完成。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学法检测组织中PROX1的表达

石蜡切片厚度为4 μm，在70 ℃下烤片30 min，随后进行脱蜡处理。用Tris/EDTA修复液进行抗原修复，羊血清封闭30 min，加入鼠抗人PROX1单克隆抗体（1∶200）4 ℃过夜，加入辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG，37 ℃温育30 min。随后用辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液和二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色液处理，苏木紫复染。经过脱水、透明、封片处理后在显微镜下观察。每张切片随机取10个视野，每个视野计数100个癌细胞，根据细胞的染色强度及阳性细胞比例判断PROX1表达情况。染色为阴性记0分、浅黄色1分、棕黄色2分、棕褐色3分；阳性细胞数为0%～10%记1分、11%～50%记2分、51%～80%记3分、81%～100%记4分，将二者评分相乘得出最终结果：0分（阴性）；1～3分（弱阳性）；4～8分（中等阳性）；9～12（强阳性）。0～3分低表达；4～12分为高表达［9］。

1.2.2 蛋白质印迹法（Western blot）检测

取对数生长期细胞加入蛋白裂解液，冰上裂解25 min后，12 000×g离心15 min后收集上清液。用BCA法检测蛋白浓度，每孔上样蛋白量为50 μg。经凝胶电泳（SDS-PAGE）后将蛋白转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，脱脂奶粉封闭1 h，温育一抗（鼠抗人PROX1单克隆抗体，1∶200），4 ℃过夜后弃去一抗，洗膜缓冲液（tris-buffered saline Tween，TBST）洗膜3次。随后室温温育二抗2 h，弃去二抗，TBST洗膜3次，每次5 min。以β-actin作为内参，采用电化学发光（electrochemical luminescence，ECL）仪对蛋白成像，采用Image J软件分析灰度值。

1.2.3 细胞转染

以2×105个细胞/孔将A549细胞接种于6孔板中。转染前用PBS洗涤细胞2次，加入1.8 mL无血清培养基。分别用100 μL无血清培养基稀释10 μL LipoFiter和10 mL si-RNA（或者si-control），静置5 min后将二者混匀，混合物加入6孔培养板中，转染6 h。si-RNA序列为5’-GGACGGGAAGUUAGACAAAGA-3’；si-control序列为5’-GGAAGUUAGACAA AGAUGAGA-3’。

1.2.4 克隆形成实验

转染24 h后，用2.5 g/L胰蛋白酶消化细胞，以1 000个细胞/孔将细胞接种于6孔培养板中，置于37℃、CO2体积分数为5%培养箱中培养中，培养3周，每3 d换液1次。当出现菌落时停止培养，弃去培养基。用4%多聚甲醛固定30 min，随后用结晶紫染色，统计每孔克隆数目。实验重复4次。

1.2.5 细胞增殖实验

转染后将细胞以10 000个/孔接种于24孔板中，使用CCK-8试剂盒检测细胞活性，培养24、48、72和96 h后，向每孔中添加10 μL CCK-8，继续培养4 h。用微孔板阅读器在490 nm波长处读取吸光度（D）值。实验重复4次。

1.2.6 Transwell侵袭与迁移实验

在transwell迁移板下室每孔中加入600 μL培养基。转染后以5×104个细胞/孔的密度将细胞铺于transwell迁移板上室中，温室培养24 h。弃去上室培养基，用PBS洗涤2次，随后用4%多聚甲醛固定30 min，结晶紫染色15 min。用棉签拭去上室上层黏附的细胞，进行拍照和计数。对于侵袭试验，首先在transwell迁移板上室铺基质胶，每孔接种1×105个细胞，侵袭48 h后进行分析，步骤同迁移实验。实验重复4次。

1.3 统计学处理

用SPSS 19.0进行统计学分析。两组间计量资料比较用t检验，计数资料比较用χ2检验；多组间比较用单因素方差分析；等级资料采用非参数检验；重复测量资料用重复测量方差分析；生存分析用Kaplan-Meier法，多因素分析用COX比例风险回归模型。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PROX1在NSCLC中的表达

免疫组织化学检测结果显示，NSCLC组织和癌旁组织中PROX1有不同程度的表达，PROX1主要分布在细胞核里，在细胞质中也有表达（图1）。癌组织中PROX1阴性、弱阳性、中等阳性、强阳性分别6例、25例、20例、35例；癌旁组织中分别48例、27例、8例、3例，癌组织中PROX1阳性表达率明显高于癌旁组织（Z=-8.021，P＜0.001）。Western blot检测结果显示，与Beas-2b相比，A549、H460、H1229和H358细胞系中PROX1蛋白表达水平明显较高（P均＜0.05，图2）。

2.2 PROX1与NSCLC临床病理学特征及预后的关系

PROX1高表达组淋巴结转移率和TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期的占比明显高于低表达组（P＜0.05）。

COX多因素分析结果显示，TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、淋巴结转移、远处转移和PROX1高表达是NSCLC患者不良生存预后的独立影响因素（P＜0.05）。PROX1高表达组生存时间明显短于低表达组（P＜0.001，图3，表1、2）。

2.3 下调PROX1对A549细胞增殖、迁移和侵袭的影响

与si-control组比较，si-RNA组PROX1蛋白表达水平、细胞克隆数目、培养第72和96 h时细胞增殖的D值、侵袭和迁移细胞数量明显较低（P＜0.01，图4～5）。

图1 免疫组织化学法检测PROX1在NSCLC组织中的表达Fig.1 PROX1 expression in NSCLC tissues detected by immunohistochemistry

图2 Western blot检测细胞中PROX1蛋白表达水平（n=4）Fig.2 Western blot detection of PROX1 protein expression in cells (n=4)

图3 PROX1高表达和低表达患者的生存时间比较Fig.3 Comparison of survival time between patients with high and low PROX1 expression

表1 PROX1与NSCLC临床病理学特征的关系Tab.1 Relationship between PROX1 and clinicopathological characteristics of NSCLC［n (%)］

表2 NSCLC患者生存时间的影响因素分析Tab.2 Analysis of factors influencing the survival time of NSCLC patients

图4 敲降PROX1对A549细胞PROX1蛋白表达水平的影响（n=4）Fig.4 The effect of knockdown PROX1 on the expression level of PROX1 protein in A549 cells (n=4)

图5 敲降PROX1对A549细胞增殖、迁移和侵袭的影响（n=4）Fig.5 Effect of knockdown PROX1 on proliferation,migration and invasion of A549 cells (n=4)

3 讨 论

肺癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一，其发病机制复杂，目前尚未完全明确。本研究发现，癌组织中PROX1阳性表达率明显高于癌旁组织，并且PROX1与肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移有关，可能成为NSCLC潜在的分子生物学标志物。

PROX1在1996年首次被分离，是果蝇的同源异形盒基因prospero在哺乳动物中的同源框基因转录因子。PROX1在乳腺癌、甲状腺癌和胶质瘤组织中高表达，并且与肿瘤发生、发展关系密切［4-6］。本研究采用免疫组织化学法检测了86例NSCLC组织中PROX1的表达，结果显示，癌组织中PROX1高表达55例（63.95%），癌旁组织高表达11例（12.79%），组间比较差异有统计学意义。另外，与人支气管上皮细胞Beas-2b相比，A549、H460、H1229和H358细胞系中PROX1蛋白表达水平明显较高。本研究还发现，敲低PROX1基因后，A549细胞增殖、迁移和侵袭明显受到抑制。说明PROX1可能作为癌基因参与NSCLC的发生。

PROX1在癌症中的作用机制尚未明了，可能为：①结合并抑制基质金属蛋白酶-14表达，进而参与肿瘤血管生成和肿瘤侵袭［10］；②通过核小体重塑和去乙酰化酶复合物抑制Notch信号通路，进而抑制肿瘤细胞的增殖［11］；③参与免疫炎症损伤，通过激活核因子κB促进瘤细胞增殖和侵袭；④表达于淋巴管内皮细胞，参与肿瘤淋巴管新生和肿瘤淋巴道转移［3］。

本研究结果显示，PROX1表达与淋巴结转移和肿瘤分期密切相关。在多种类型肿瘤中，淋巴管是肿瘤转移的主要途径。PROX1主要分布在淋巴管内皮细胞核里，在肿瘤组织内皮细胞中表达上调［12］。既往研究［13-14］发现，PROX1有促进内皮细胞分化和淋巴管形成的作用，可能会作为预测肿瘤淋巴道转移的关键因子。本研究86例患者中发生远处转移12例，其中PROX1高表达10例，占83.33%；未发生远处转移的74例患者中PROX1高表达45例，占60.81%，但两组比较差异无统计学意义，可能与样本量小有关。

TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、淋巴结转移和远处转移是NSCLC患者不良生存预后的影响因素，既往已被证实［15-17］。PROX1高表达与多种肿瘤的不良生存预后有关，如乳腺癌［18］、胃癌［19］和唾液腺样囊性癌［20］等。本研究COX多因素分析结果显示，PROX1是NSCLC患者不良生存预后的独立影响因素，PROX1高表达组生存时间明显短于低表达组。

综上所述，PROX1在NSCLC发生、发展中可能起到重要作用，敲降PROX1基因可以抑制NSCLC细胞的增殖、侵袭和迁移。PROX1与NSCLC患者淋巴结转移及肿瘤TNM分期有关，PROX1高表达可能预示患者不良生存预后。本研究也存在一些局限性，例如未分析PROX1下游分子的变化，临床样本量较小。未来需要深入探讨PROX1在NSCLC中的作用机制。