去脂软肝方对非酒精性脂肪性肝病大鼠模型小肠中有机阴离子转运多肽2B1 mRNA和蛋白表达水平的影响

张素妍， 夏恩蕊， 周青丽， 张顺贞

云南中医药大学 a.中药学院； b.基础医学院， 昆明 650000

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一种与胰岛素抵抗和遗传易感密切相关的代谢应激性肝损伤，是最常见的肝脏疾病之一，发病率逐年增加[1-3]。NAFLD的发生与代谢综合征在中医病因病机及体质类型和证候特点上具有高度一致性[4]。小肠是物质吸收、消化的重要部位，而且有机阴离子转运多肽(organic anion transporting polypeptide，OATP) 2B1是水液代谢中重要的物质基础，因此本实验用去脂软肝方对NAFLD大鼠进行干预，探讨其对NAFLD大鼠小肠组织中OATP2B1水平的影响，进一步阐明其分子机制，为相关临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 SD雄性大鼠(180～220 g)36只[购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，生产许可证号:SCXK(湘)2016-0002，实验单位使用许可证编号:SYXK(滇)K2013-0002]。去脂软肝方(由莪术、白术、山楂、菊花、三七、青皮、兰花参七味中药组成)；辛伐他汀片(Merck Sharp & Dohme B.V. ，批号:RO13440)。高脂饲料(88%普通饲料、10%猪油、2%胆固醇)、普通饲料均购自楚商生物有限公司。Ultrapure RNA Kit RNA提取试剂盒(康为世纪生物科技有限公司，批号:CW0581S)；SuperRT cDNA Synthesis Kit cDNA合试剂盒(康为世纪生物科技有限公司，批号:CW0741S)；UltraSYBR Mixture(High ROX)(康为世纪生物科技有限公司，批号:CW2602M)；OATP2B1抗体(PL Laboratories，批号:PL0305169)；GAPDH抗体(ABCAM，批号:ab181602)；HRP-山羊抗小鼠IgG(H+L)(Beyotime，批号:A0216)；HRP-山羊抗兔IgG(H+L)(Beyotime，批号:A0208)； Marker(Beyotime，批号:P0066)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(Solarbio，批号:PC0020)；超敏ECL发光试剂盒(CLiNX，批号:1810202)等。酶标仪(BioTek，EPOCH)；荧光定量PCR仪(Heal Force，CG)；CO2培养箱(Thermo3111)；显微镜(奥林巴斯CX23)；移液器(Eppendorff)；垂直板电泳装置(Tanon VE-180PRE)；垂直板电泳胶转膜仪装置(Tanon VE-586)；Odyssey双色红外荧光成像系统(CLiNX，6000 pro)等。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及给药 36只SD大鼠适应性喂养1周后，随机分为6组，即正常组、模型组、辛伐他汀组、去脂软肝方高、中、低剂量组，每组各6只。正常组给予普通饲料，其余各组均给予高脂饲料造模。造模的同时预防给药，正常组、模型组用生理盐水灌胃(1 ml·100 g-1·d-1)，辛伐他汀组用辛伐他汀片灌胃给药(1.8 mg·kg-1·d-1)，去脂软肝方高、中、低剂量组分别按生药量27.72 g·kg-1·d-1、13.86 g·kg-1·d-1、6.93 g·kg-1·d-1进行灌胃给药，生药浓度分别为2.77 g/ml、1.39 g/ml、0.69 g/ml，给药体积为1 ml·100 g-1·d-1。第14周末实验结束后，处死动物，采集血清、肝脏及小肠样本，-80 ℃保存，部分肝脏用4%多聚甲醛固定,室温保存。

1.2.2 肝指数检测 取材时，称定大鼠体质量和肝湿重，肝指数=(肝湿重/体质量)×100%。

1.2.3 血清肝功能指标 采用全自动生化仪检测大鼠ALT、AST、血糖(GLU)、血清胆固醇(CHOL)水平。

1.2.4 肝组织病理 大鼠肝脏用4%多聚甲醛固定后，常规制备肝组织石蜡切片，HE染色，显微镜下拍片。

1.2.5 RT-PCR法检测小肠组织中OATP2B1 mRNA表达量 按试剂盒说明提取RNA，测定浓度和纯度。利用Primer3软件设计引物序列，由华大基因合成，以RT-PCR方法检测目的基因的mRNA水平。

1.2.6 Western Blot检测小肠组织中OATP2B1蛋白表达水平 取-80 ℃下保存的大鼠小肠组织，提取总蛋白后测定其浓度，每孔加40 μg总蛋白上样，进行SDS-PAGE凝胶电泳，湿转法电转移至硝酸纤维素膜，以1% 牛血清白蛋白对膜进行封闭40 min，再加入一抗与对照抗体，4 ℃孵育过夜，洗膜后加HRP标记的二抗，37 ℃孵育1 h，洗膜，ECL试剂曝光显影。

1.3 伦理学审查 本研究方案经由云南中医药大学实验动物伦理委员会审批(批号：R-082018075)，符合实验室动物管理与使用准则。

2 结果

2.1 肝脏病理组织变化 正常组大鼠肝组织肝小叶结构完整，肝索、肝窦分布正常，肝细胞形态一致，排列整齐有序，未见明显变性坏死；模型组大鼠肝组织肝小叶结构紊乱，肝索增宽，肝窦融合，肝细胞排列紊乱，细胞形态大小不一，具有大量脂肪空泡，部分区域汇管区和小叶内有少量淋巴细胞浸润；与模型组比较，各用药组病变明显减轻(图1)。

2.2 各组大鼠肝指数比较 与正常组相比，模型组肝指数显著升高(P<0.05)；与模型组相比，去脂软肝方各用药组肝指数均明显降低(P值均<0.05);与辛伐他汀组比较，去脂软肝方各用药组肝指数亦均明显降低(P值均<0.05)(表1)。

2.3 各组大鼠血清肝功能变化 与正常组相比，模型组大鼠GLU、CHOL水平均显著升高(P值均<0.05)；与模型组相比，各用药组均能降低GLU、CHOL水平(P值均<0.05)(表2)。

表1 各组大鼠肝指数的比较

表2 各组大鼠血清肝功能指标的比较

注:a,正常组；b，模型组；c，辛伐他汀组；d，去脂软肝方高剂量组；e，去脂软肝方中剂量组；f，去脂软肝方低剂量组。

2.4 各组大鼠小肠组织OATP2B1 mRNA表达情况 与正常组相比，模型组OATP2B1 mRNA表达显著升高(P<0.05)；与模型组相比，辛伐他汀组和去脂软肝方高、中剂量组OATP2B1 mRNA表达均显著降低(P值均<0.05)；与辛伐他汀组比较，去脂软肝方中、低剂量组OATP2B1 mRNA表达均显著降低(P值均<0.05)(表3)。

表3 各组大鼠小肠组织OATP2B1 mRNA相对表达水平比较

2.5 各组大鼠小肠组织OATP2B1蛋白表达情况 与正常组相比，模型组OATP2B1蛋白表达显著增加(P<0.05)；与模型组相比，各用药组OATP2B1蛋白表达均显著降低(P值均<0.05)；与辛伐他汀组比较，去脂软肝方高、中、低剂量组OATP2B1蛋白表达均显著降低(P值均<0.05)(图2,表4)。

3 讨论

NAFLD归属于中医“胁痛”“积聚”“痞证”“肝胀”“肝癖”“肥气”等范畴[5-7]，中医认为肝脾相关，肝属木，脾属土，两者生理上相关，主要表现为肝主疏泄和脾主运化功能之间的相互促进，以及肝藏血与脾统血之间的相互配合，共同在人体的消化、吸收、血液运行及水液代谢过程中发挥重要作用。 其中肝脾二脏在饮食消化吸收方面的相关最为重要，膳食营养摄入影响NAFLD的发生与发展过程[8]，过食肥甘，导致脾失健运[9]，水谷精微不化，水湿内停，凝结成痰，痰阻气机，气机升降失调，水湿不化，久而伤肝[10]。现代医学“肠”的功能属于中医“脾”的功能已毋庸质疑，因此，肝脾相关亦可表现为现代医学中肝脏与肠道在生理病理上的相关性。“小肠者，受盛之官，化物出焉”，小肠与脾共主运化而各司其职，与机体代谢同样十分密切[9,11]。有机阴离子转运肽家族是重要的膜转运蛋白，介导大量体内外化合物的吸收，相关研究证明OATP的异常表达，与脾虚[12-13]、肝癌[14]、NAFLD[15]等多种疾病密切相关，OATP2B1作为OATP家族中重要的一员，在机体大部分器官都有表达，介导许多药物和内源性化合物的肝和肠吸收[16]，而小肠作为消化、吸收的重要部位，与OATP2B1的关系不容忽视。

注：1～6分别为正常组、模型组、辛伐他汀组、去脂软肝方高、中、低剂量组。

表4 各组大鼠小肠组织OATP2B1蛋白相对表达水平比较

去脂软肝方为云南省肝病专家、荣誉名中医苏涟教授的经验方，由莪术、白术、山楂、菊花等七味中药组成，具有柔肝健脾、理气活血的功效。本课题组前期研究证明，在该方的基础上加减治疗脂肪肝在临床上具有很好的治疗效果，同时去脂软肝方能够改善高脂饮食诱导的脂肪肝大鼠血脂、肝脂及肝组织脂肪变性及血液流变学相关指标[17]，NAFLD的病变与OATP2B1在不同器官的表达有密切联系。本实验采用高脂饮食造模14周，用去脂软肝方进行干预治疗后，去脂软肝方能够通过降低大鼠肝指数、GLU、CHOL水平改善NAFLD病变。NAFLD大鼠小肠组织中OATP2B1 mRNA和蛋白表达相对于正常组明显上调，使用去脂软肝方干预治疗后，能够显著下调OATP2B1 mRNA和蛋白水平的表达，且差异具有统计学意义。长期高脂饮食刺激，机体产生大量的“痰湿”，机体可能通过上调OATP2B1的表达，对这些异物进行转运，最终维持机体动态平衡，但是由于长期的过度刺激，OATP2B1过表达后，对这些生物体异物进行大量转运而机体不能及时将这些物质快速代谢或排泄，从而引起水液的代谢障碍。笔者认为去脂软肝方可能通过降低OATP2B1的表达，减缓NAFLD的病变程度，但是其作用机理需要进一步探讨。

利益冲突声明：本研究不存在与研究者、伦理委员会成员以及公开研究成果有关的利益冲突，特此声明。

作者贡献声明：张素妍负责课题设计，资料分析，撰写论文；夏恩蕊、周青丽参与收集数据，修改论文；张顺贞负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。