超高效液相色谱–串联质谱法同时测定蔬菜中12 种杀菌剂

李颜岩，于浩洋，冯静，陈曦，刘顺鑫

(辽宁省疾病预防控制中心，沈阳 110005)

杀菌剂是一类用来防治由病原微生物引起的植物病害的农药，因其投入低，回报高，作用迅速，效果明显，被广泛应用于蔬菜生产过程中的病害防治［1］。蔬菜作为仅次于粮食的第二大农产品，是人们日常生活中必不可少的食物之一。我国《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》(GB 2763–2019)［2］对蔬菜中杀菌剂的限值作出了相应规定。由于蔬菜生产周期和货架期均较短，如果在生产过程中没有按照相关规定控制杀菌剂的使用频次、浓度和安全间隔期，容易造成蔬菜中杀菌剂残留超标，进而危害人们身体健康［3］。我国种植的蔬菜品种多，病害和杀菌剂种类也繁多，为了扩大防治范围、减缓抗药性、节省喷药次数，经常将几种杀菌剂混合在一起使用［4］，因此建立快速、准确，可同时测定多种杀菌剂的方法十分必要。

目前检测杀菌剂常用的方法有气相色谱法［5–6］、气相色谱–串联质谱法［7–10］、液相色谱法［11–13］和液相色谱–串联质谱法［14］。气相色谱法和液相色谱法通过保留时间定性，相比质谱法定性能力有限，同时检测多种杀菌剂时，难以获得较好的分离效果。近年来随着高效、低毒、低残留杀菌剂品种不断涌现和越来越多非挥发性农药的研发，一些难挥发、热稳定性差的杀菌剂不适合采用气相色谱–串联质谱法检测，而液相色谱–串联质谱法多通道检测功能不需要分析物之间实现完全色谱分离，一次性检测多种化合物而不被干扰，可以缩短分析时间，且灵敏度较气相色谱–串联质谱法高。样品前处理是检测过程中耗时最长、工作量最大的部分，样品前处理质量的好坏直接影响分析结果的准确性和精密度。目前常用的样品前处理方法主要有衍生法、液–液萃取法、固相萃取法等。衍生法对衍生反应条件、人员操作熟练度要求严格；液–液萃取法和固相萃取法需要用大量的有机溶剂反复提取、定容，操作时间长，试剂用量大，检测成本高，且容易造成待测物损失，影响检测结果准确度。基于QuEChERS 原则的样品处理技术操作简便，对实验人员熟练度要求不高，试剂用量相对较少，分析范围广，速度快，准确度高，近年来受到人们的广泛关注，其应用范围不断扩大。然而用该方法处理蔬菜样品，采用超高效液相色谱–串联质谱同时测定蔬菜中12 种常见杀菌剂的方法还没见报道。笔者以乙腈为提取液对蔬菜样品进行萃取，上清液经QuEChERS 分散固相萃取试剂盒净化，建立了超高效液相色谱–串联质谱法同时测定蔬菜中12 种常见杀菌剂残留的检测方法。该方法试剂用量少，分析速度快，具有较高的准确度和灵敏度，可以为蔬菜中杀菌剂残留风险评估提供科学、可靠的检测数据。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

超高效液相色谱仪–串联质谱仪：Acquity Xevo TQ 型，美国沃特斯公司；

电子天平：BS 110S 型，感量为0.1 mg，德国赛多利斯公司；

超纯水系统：MILLI–Q Gradient 型，法国默克密理博公司；

涡旋振荡器：Lab Dancer 型，德国艾卡公司；

台式高速冷冻离心机：ST16R 型，美国赛默飞世尔科技公司；

高速离心机：TGL–16A 型，上海安亭科学仪器厂；

QuEChERS 分 散 固 相 萃 取 试 剂 盒：5982–0028CH 型，规格为2 mL，内含PSA 50 mg，C1850 mg，GCB 7.5 mg，MgSO4150 mg，美国安捷伦科技公司；

Pall-4544 PVDF 膜Acrodisc 针式滤器：孔径为0.2 μm，直径为13 mm，美国颇尔公司；

乙腈、甲醇：色谱纯，美国费希尔公司；

甲酸：色谱纯，美国福禄克公司；

乙酸铵：色谱纯，德国CNW 公司；

蔬菜样品：市购；

多菌灵、三唑酮、烯酰吗啉、腐霉利、吡唑醚菌酯、恶霜灵标准品：纯度均大于97%，德国Dr.Ehrenstorfer 有限公司；

腈菌唑标准品：纯度为99.6%，德国西格玛奥德里奇公司；

实验用水为超纯水；

5 种杀菌剂标准溶液：基本信息见表1。

表1 5 种杀菌剂标准溶液基本信息

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3 柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm，美国沃特世公司)；柱温：40℃；进样体积：10.0 μL；流动相：A 为乙腈，B 为0.05%甲酸水溶液；洗脱方式：梯度洗脱，流量为0.30 mL／min；梯度洗脱程序见表2。

表2 梯度洗脱程序

1.2.2 质谱条件

离子化模式：正离子电离模式(ESI+)；检测方式：多反应监测(MRM)模式；离子源温度：150℃；毛细管电压：2.9 kV；锥孔反吹气流量：50 L／h(氮气)；锥孔气流量：50 L／h；脱溶剂气温度：500℃；脱溶剂气流量：800 L／h；12 种杀菌剂质谱参数和 保留时间见表3。

表3 12 种杀菌剂质谱参数和保留时间

1.3 样品前处理

将采集的蔬菜样品按GB／T 27404–2008［15］中蔬菜样品的制备要求进行捣碎均质，放入密封样品袋、塑料离心管或广口瓶中，标记好样品信息，于–18℃冰箱中保存备用。准确称取5.0 g 均质后的蔬菜样品，置于50 mL 塑料离心管中，加入10.0 mL 乙腈涡旋萃取5 min，然后以10 000 r／min 转速离心5 min。取1.0 mL 上清液加入至QuEChERS分散固相萃取试剂盒中，手动振摇5 min，涡旋1 min，然后以10 000 r／min 转速离心3 min，上清液过PVDF 膜后上机测定。

1.4 溶液配制

多菌灵、三唑酮、烯酰吗啉、腐霉利、吡唑醚菌酯、恶霜灵、腈菌唑7 种杀菌剂标准储备溶液：1 000 μg／mL，准确称取7 种杀菌剂标准品各0.01 g，分别置于7 只10 mL 容量瓶中，加入适量甲醇溶解，完全溶解后继续加入甲醇定容至标线，摇匀，于–18℃冰箱中保存。

5 种杀菌剂标准溶液于–18℃冰箱中保存备用。

12 种杀菌剂混合标准工作溶液：分别准确吸取上述7 种杀菌剂标准储备溶液和5 种杀菌剂标准溶液各适量，置于同一只10 mL 容量瓶中，用乙腈稀释并定容至标线，摇匀，配制成腐霉利的质量浓度为10 μg／mL，吡唑醚菌酯、腈菌唑、恶霜灵的质量浓度均为2 μg／mL，其它杀菌剂的质量浓度均为1 μg／mL 的混合标准工作溶液，于4℃条件下保存。

系列基质标准工作溶液：称取5 份均质后的阴性蔬菜样品各5.0 g，置于5 只50 mL 塑料离心管中，分别加入适量体积的混合标准工作溶液和乙腈共10.0 mL，配制成腐霉利的质量浓度分别为5.0，20.0，100.0，500.0，1 000.0 μg／L，吡 唑醚 菌酯、腈菌唑、恶霜灵的质量浓度均分别为1.0，4.0，20.0，100.0，200.0 μg／L，其它杀菌剂的质量浓度均分别为0.5，2.0，10.0，50.0，100.0 μg／L 的系列基质标准工作溶液。基质标准工作溶液按1.3 样品前处理方法进行处理。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件优化

分别以相同比例的乙腈和甲醇与水混合作为流动相进行试验，发现在低比例混合时，乙腈的洗脱能力更强，且压力较低，12 种杀菌剂的色谱峰形和响应值均好于甲醇为流动相时，因此选用乙腈–水溶液作为流动相。在正离子模式下，向水相中加入甲酸可以提高离子化效率，考虑到恶霜灵和嘧霉胺在弱酸至弱碱性条件下稳定，可以适当减少甲酸的加入量，故B 相选用0.05%甲酸水溶液。分别以乙腈–0.05%甲酸水溶液、乙腈–0.05%甲酸水溶液(含5 mmol 乙酸铵)为流动相，考察12 种杀菌剂混合标准工作溶液的色谱峰形和响应值，结果发现，在B相中加入乙酸铵可以改善待测化合物的色谱峰形，但会降低目标物的响应值，比较加入乙酸铵前后的色谱图，发现色谱峰形改善不明显，但12 种杀菌剂的响应均受到一定程度的抑制，尤其是对响应较低的腐霉利影响较大，故B 相中不加乙酸铵。因此选用乙腈–0.05%甲酸水溶液为流动相。

以乙腈–0.05%甲酸水溶液为流动相，分别采用ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)和ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1 mm×100 mm，1.8 μm)两种色谱柱对12 种杀菌剂混合标准工作溶液进行分离，发现采用ACQUITY UPLC HSS T3 柱能够获得较好的色谱峰形和分离效果，故选择ACQUITY UPLC HSS T3 柱作为分析柱。

以乙腈–0.05%甲酸水溶液为流动相，采用ACQUITY UPLC HSS T3 柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)对12 种杀菌剂混合标准工作溶液进行分离，结果表明，梯度洗脱比等度洗脱分析时间短，且可以克服等度洗脱时间越长化合物色谱峰越宽的缺点。优化的梯度洗脱程序见表2。在优化条件下12 种杀菌剂提取色谱图如图1 所示。

图1 12 种杀菌剂提取色谱图

2.2 质谱条件优化

由于12 种杀菌剂中含有氨基、仲胺或叔胺基团，容易得到加成的正离子，在正离子电离模式(ESI+)下，可获得丰度较高的［M+H］+母离子。通过子离子扫描方式选择响应最大的两个碎片作为子离子，确定定量离子对和定性离子对，并对碰撞能量等质谱条件进行优化。优化的质谱参数见表3。

2.3 净化方法选择

QuEChERS 分散固相萃取试剂盒中装有PSA(N-丙基乙二胺)，C18，GCB(石墨化碳黑)和MgSO4，其中PSA 可以去除蔬菜样品中的有机酸、脂肪酸、糖类、酚类以及极性色素；C18可以去除样品中的脂肪、固醇及其它非极性干扰物，对于含脂肪较高的蔬菜样品(黄豆芽等)有很好净化效果；蔬菜样品中往往色素含量很高，GCB 可以有效去除样品中的色素；MgSO4可以去除样品中的水分且不溶于乙腈，不会造成离子源的污染。经QuEChERS分散固相萃取试剂盒处理后的样品可以得到很好的回收率和精密度，且操作步骤简单。因此选择QuEChERS 分散固相萃取试剂盒对样品提取液进行净化。

2.4 提取液选择

QuEChERS 分散固相萃取试剂盒常用乙腈或酸化乙腈(1%乙酸乙腈溶液)作为提取液，考虑到恶霜灵和嘧霉胺在弱酸到弱碱性条件下稳定，因此选择用乙腈为提取液。称样质量(m)与提取液体积(V)比对提取效率有明显影响，刘佳等［16］研究表明，当m∶V=1∶2 时，回收率显著增加。准确称量5 g 样品，分别考察5，10，15 mL 乙腈对12 种杀菌剂的提取效果，结果显示5 mL 乙腈的提取效率明显低于10 mL 和15 mL 乙腈的提取效率，而10 mL 和15 mL 乙腈的提取效率差别不大，考虑到经济效益和环境保护，选择10 mL 乙腈为提取液。

2.5 线性方程与检出限

选取根茎类蔬菜萝卜和叶菜类蔬菜白菜为基质，按1.3 方法配制系列基质标准工作溶液，在1.2仪器工作条件下进行测定。以12 种杀菌剂的质量浓度(X)为横坐标，定量离子对色谱峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准工作曲线，计算线性回归方程和相关系数。将基质标准工作溶液逐级稀释，在1.2 仪器工作条件下进行测定，以3 倍信噪比对应的质量浓度作为方法检出限。12 种杀菌剂的线性范围、线性方程、相关系数及检出限见表4。

表4 12 种杀菌剂的线性方程、线性范围、相关系数及检出限

由表4 可知，两种基质中12 种杀菌剂在各自的质量浓度范围内线性关系良好，相关系数均大于0.998，方法检出限为0.02～0.66 μg／kg。

2.6 加标回收与精密度试验

准确称取5.0 g 阴性萝卜和白菜样品各18 份，分别加入适量的12 种杀菌剂混合标准工作溶液，按1.4 方法进行样品处理，在1.2 仪器工作条件下分别进行低、中、高3 个浓度水平的加标回收试验，每个浓度水平平行测定6 次，结果见表5。由表5 可知，12 种杀菌剂的平均加标回收率为93.6%～107.5%，测定结果的相对标准偏差为0.93%～3.75%，满足测定要求。表明该方法具有较高的准确度和精密度。

表5 加标回收与精密度试验结果

2.7 样品测定

用所建方法对市售的16 份蔬菜样品进行测定，结果显示，多菌灵和甲霜灵阳性样品各1 份，测定值均为11 μg／kg，苯醚甲环唑阳性样品3 份，测定值分别为6，9，40 μg／kg，均低于各自限值［2］，其余杀菌剂均未检出。

3 结语

建立了12 种常见杀菌剂超高效液相色谱–串联质谱检测方法。选取乙腈为提取液，用QuEChERS 分散固相萃取试剂盒对蔬菜样品进行净化，减少了有机试剂用量，操作简便，缩短了样品前处理时间。采用基质标准工作曲线法进行定量，在降低基质效应的同时补偿了净化过程中杀菌剂的损失。该方法准确度高，精密度好，选择性强，大样本量检测时间短，适用于蔬菜样品中多种杀菌剂的同时测定，可以为蔬菜中杀菌剂残留风险评估提供科学、可靠的检测数据。