间充质干细胞来源的外泌体在肝癌治疗中的研究进展*

朱丹 李汛

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）简称肝癌，在全球死亡率居第四位，在常见恶性肿瘤中居第六位［1-2］。肝癌的治疗方法包括：手术切除（包括部分肝切除和肝移植）、肿瘤消融、放疗、经肝动脉和（或）门静脉区域化疗和（或）经肝动脉化疗栓塞（transhepatic artery chemoembolization，TACE）、全身药物治疗等。约70%的肝癌患者治疗后5年内出现肿瘤复发或转移［3］。肝癌对现有的化疗药物均不敏感，仅有的靶向药物索拉非尼，也只观察到有限的疗效，其中生存期仅延长3个月［4］，有效率仅2%［5］。

MSCs是中胚层来源的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的干细胞，广泛存在于全身多种组织中，可以在不同条件下诱导分化为多种组织细胞，神经细胞、软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞等［6］。MSCs 具有广阔的临床应用前景，是细胞替代治疗的首选细胞和研究热点。MSCs可以抑制肝纤维化的进展并且能够有效治疗肝纤维化［7-8］。但大量关于MSCs 治疗肝癌的研究结果并不一致，有些研究结果显示其可以抑制肝癌，有些研究结果却显示MSCs促进肝癌的增殖、生长、转移甚至耐药［9-10］。然而不管是MSCs 用于治疗肝纤维化还是肝癌，因其输入体内存活时间短、达不到起效时间且具有免疫排斥性、致瘤性等安全性隐患，MSCs 用于临床的可行性一直存在着争议。近年来研究发现，MSCs 可通过分泌外泌体发挥作用，MSC-Exo 不仅含有MSCs 的遗传信息，且能够克服复杂的体内递送障碍（包括单核细胞清除、细胞黏附和内吞作用），可以远距离长时间运输，无免疫排斥，无致瘤性，应用于临床更具安全性［11-12］。因此，MSC-Exo对肝癌等疾病的作用备受关注。本文就关于MSC-Exo应用于肝癌治疗方面的研究进行综述。

1 外泌体与MSC-Exo

外泌体（exosome）是特指由细胞释放到生物体液中的具有脂质双分子层，直径在30～100nm的盘状囊泡，由多种细胞在正常或病理状态下分泌释放到细胞微环境中［13-14］。尽管外泌体在1983年就被发现，但当时被认为只是一种细胞的废弃物［15］，直到最近几年才发现这种微小膜泡中含有细胞特异的蛋白、脂质和核酸，可作为信号分子传递给其他细胞从而改变其功能［16-17］。作为一个新型的研究热点，外泌体具有在体内广泛性存在和获取的便捷性，作为药物等运载体具有能被受体细胞吸收、免疫原性低、运输效率高、稳定性好和靶向性强等优点［18-19］。目前一些研究机构已经建立许多关于外泌体研究的数据库，如Vesiclepedia、ExoCarta、EVpedia、EVmiRNA、exoRBase 及ExoBCD 等，为外泌体的研究提供了重要资源。外泌体的分离提取方法主要有超速离心法、超滤法、免疫磁珠法、聚乙二醇沉淀法、排阻色谱法、微流控芯片技术等，但这些方法各具局限性［20-21］。提取外泌体使用最多的方法是超速离心法，更多的研究人员通常联合使用两种方法来分离纯化外泌体［22］。外泌体主要的分子标记物有CD63、CD81、CD9、TSG101、Alix 等［23-25］，而用于鉴定的主要为CD63、CD81。关于外泌体鉴定的方法主要包括利用蛋白免疫印迹法（Western blot，WB）检测分子标记物［26］；利用透射电镜（transmission electron microscope，TEM）观察超微结构及测量其粒径［27］；利用动态光散射法（dynamic light scattering，DLS）或纳米粒子追踪分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）检测粒径分布情况［28］。MSCs具有丰富的分泌活性和强大的分泌外泌体的能力［29］。不同来源的MSCs 都可分泌外泌体，但分泌的数量和性质有所不同。但不管是哪种来源的MSCs，都可通过MSC-Exo 实现与其他细胞之间的信息传递。虽然MSC-Exo 具有多种功能，但目前的研究显示其在一些方面的功能的具有双重性，如对免疫调节和肿瘤的双重作用［30］，具体作用机制也尚未完全阐明。

2 MSC-Exo与肝癌

反复或急、慢性的肝脏损伤可导致肝纤维化、肝硬化甚至肝癌的发生。MSCs抑制纤维化甚至可以通过阻止肝纤维化治疗肝硬化［31］。而MSCs 作用于肝癌的研究有两种截然相反的结论：一种是抑制肝癌的发生、发展及侵袭［32］；另一种是促进肝癌增殖、转移及侵袭［33-35］。目前一些研究显示MSC-Exo 可以通过不同机制保护肝脏，抑制肝癌的发展、转移和耐药，但详细的机制尚不清楚（表1）。

表1 MSC-Exo在肝癌及肝脏转移性肿瘤中的作用

表1 MSC-Exo 在肝癌及肝脏转移性肿瘤中的作用（续表1）

2.1 MSC-Exo保护肝脏的机制

MSC-Exo 可通过多种机制保护肝脏和促进药物性损伤肝细胞再生。在CCL4 诱导的BALB/c 裸鼠急性肝损伤模型中，人脐带MSC-Exo 可通过减少肝细胞的氧化应激保护肝脏，且抑制CCL4 和H2O2 处理的肝细胞（LO2）氧化应激并减少其凋亡。深入研究发现是外泌体中的GPX1通过诱导ERK1/2磷酸化和Bcl2 基因表达以及抑制IKKB/NFkB/Caspase9/3 信号通路，减少肝细胞氧化损伤和抑制肝细胞凋亡［36］。其他研究结果也表明人脐带MSC-Exo可通过抗氧化应激效应抑制CCL4 诱导的肝损伤［58］。在利用肝门阻断和小块肝移植造就的野生型Lewis 大鼠肝脏缺血再灌注急性损伤模型中，大鼠骨髓MSC-Exo 通过减少炎性介质的产生，抑制肝细胞凋亡以及促进肝细胞再生保护肝脏［37］。有研究在CCL4 诱导的急性C57BL/6 小鼠肝损伤模型中，通过腹腔注入人胚胎MCS-Exo 后发现小鼠血清ALT 和AST 下降。在APAP 和H2O2处理过的肝细胞（TAMH、THLE-2、Huh-7）中加入外泌体干预后，发现人胚胎MCS-Exo可以通过上调肝细胞再生基因NF-κB、Cyclin D1、Cyclin E等，上调抗凋亡基因Bcl-xL以及下调凋亡基因Caspase 3/7等，调节细胞周期来抑制肝细胞凋亡和促进其增殖进而促进肝脏再生［38］。在D-氨基半乳糖和TNF-α诱导C57BL/6小鼠爆发性肝衰竭模型中，骨髓MSC-Exo 提高小鼠生存率，缓解肝脏炎性反应和肝细胞损伤，利用肝细胞深入研究发现是外泌体中的lncRNAY-RNA-1 起关键作用［39］。还有研究表明骨髓MSC-Exo可以在S100诱导的C57BL/6小鼠自身免疫性肝炎模型中抑制肝损伤，其机制可能与外源性miRNA-223 调节NLRP3 和Caspase-1 有关［40］。外泌体中其他microRNA 在肝损伤中也起重要作用，如脐带MSC-Exo通过携带miRNA-455-3p抑制IL-6相关的信号通路，改善CCL4 和LPS 诱导的C57BL/6 小鼠急性肝损伤［41］。有研究发现脐带MSC-Exo携带miRNA-20a 可通过抑制Beclin1 和FAS 介导的自噬和凋亡减轻雄性Sprague Dawley 大鼠的肝脏缺血/再灌注损伤［42］。另外，有研究表明用TNF-α 预处理的脐带MSC-Exo 通过抑制巨噬细胞中NLRP3 的活化，改善LPS 和D-GalN 诱导的C57BL/6 小鼠急性肝损伤［43］。总之，大量研究结果已经证实，MSC-Exo 可以通过各种机制抵抗肝脏损害发挥保护肝脏的作用。

2.2 MSC-Exo在肝癌中的作用。

越来越多的研究表明外泌体在肿瘤及肿瘤相关疾病过程中发挥重要作用。其他细胞可通过外泌体传递信息，实现与肿瘤细胞之间的交流、影响肿瘤细胞的生物学特征进而调控肿瘤细胞的生长。虽然MSCs 对肿瘤细胞具有双重作用，但一些研究结果显示MSC-Exo可以抑制肝癌等肿瘤的发展、转移［59-60］。

2.2.1 MSC-Exo 抑制肝癌的发展 有研究发现在N1S1 肝癌细胞肝脏原位种植的Fischer-344 大鼠肝癌模型中，静脉注射脂肪MSC-Exo后，用MRI检测发现肿瘤逐渐缩小，进一步检测发现血清中的自然杀伤T（NKT）细胞表面标志物升高［44］。该研究认为脂肪MSC-Exo可通过促进NKT细胞的抗肿瘤效应而抑制肝癌的发展。还有研究表明髓MSC-Exo可抑制二乙基亚硝胺（diethylnitrosamine，DEN）诱导的Albino大鼠肝癌的进展和转移，表现为调亡基因Bax、P53等和血管内皮生长因子（VEGF）的下调，抗凋亡基因Bcl2 和核增殖基因PCNA 的上调［45］。另外有研究用骨髓MSC-Exo作用于严重联合免疫缺陷（severe combined immunodeficiency，SCID）小鼠皮下注射的Hep G2肝癌细胞、KAPOSI肉瘤细胞、SKOV-3卵巢癌细胞的肿瘤模型，发现其可抑制这三种肿瘤细胞的细胞周期进程，并诱导其凋亡或坏死，并且在体外实验中发现骨髓MSC-Exo诱导HepG2细胞凋亡和细胞周期阻滞［46］。肝脏来源的MSC-Exo 也可抑制肝癌的进展，有研究表明肝脏来源的MSC-Exo 促进HepG2 肝癌细胞凋亡并抑制其增殖，作用于SCID 小鼠皮下注射的Hep G2 细胞的肝癌模型抑制成瘤，而使用针对HepG2 肝癌细胞的miRNA-451，miRNA-223，miRNA-24，miRNA-125b 和miRNA-31 的抑制剂则降低了肝脏来源的MSC-Exo 的促HepG2 细胞凋亡活性［47］。令人惊讶的是，研究发现在2 型糖尿病中，脐带MSC-Exo可减轻对乙酰氨基酚对HepG2肝癌细胞的损害［48］。总之，不同来源的MSC-Exo 可减轻肝脏损伤，但在肝癌中的作用机制尚需进一步研究。

2.2.2 MSC-Exo 作为载体传递抗肝癌物质 miRNA-122 是多功能基因，除了可以抗炎、抗纤维化外对肝癌也有一定的作用［61］。研究表明miRNA-122可以促进肝癌细胞对化疗药物的敏感性。有研究将皮下注入HepG2 细胞的BALB/c 裸鼠肝癌模型，用抗肝癌药物5-氟尿嘧啶（5-FU）治疗后再用携带miRNA-122 的脂肪MSC-Exo 处理，发现相对于单纯的外泌体，携带miRNA-122 的脂肪MSC-Exo 抑制裸鼠成瘤效果更明显，并且提高了肝癌细胞（HepG2、Huh7）对5-FU 的药物敏感性［49］。还有研究利用小干扰RNA（siRNA）敲低骨髓MSCs的GRP78基因后提取的外泌体与抗肝癌药物索拉菲尼同时作用于BALB/c裸鼠肝癌皮下成瘤模型及体外肝癌细胞（HepG2、PLC），发现敲低GRP78基因后的骨髓MSC-Exo提高索拉菲尼的抗肝癌敏感性［50］。最近的一项研究表明，来源于脂肪的MSC-Exo 可通过携带miRNA-199a 调节mTOR 信号通路提高肝癌化疗的敏感性［51］。还有研究发现miRNA-199a-3p 可通过靶向YAP1 抑制Jagged1-Notch 信号通路抑制肝癌细胞增殖并诱导凋亡［62］。其他如miRNA-497、miRNA-506 等也可通过各种机制抑制肝癌细胞增殖并诱导凋亡［63-64］。也有研究表明外泌体可介导LncRNA 的转移进而调节肝癌的化疗敏感性［65］，因而MSC-Exo 可携带或装载各种小分子物质和药物进而通过各种机制影响肝癌的发展、转移和耐药。而利用MSC-Exo 作为载体携带抗肝癌的药物或基因等物质，目前主要是通过转染，共孵育和电穿孔等方法，然而这些方法各自存在缺陷，如装载效率低、破坏外泌体脂质结构等问题［66］。

2.2.3 MSC-Exo 在肝脏转移性肿瘤中的作用 虽然MSC-exo可通过各种机制抑制肝癌的发展、转移和耐药，但MSC-Exo 对肿瘤同样具有促进作用。早期的一些研究显示，骨髓MSC-Exo 在体外可促进胃癌细胞（SGC-7901）、肺成纤维细胞（HLF-1）、结肠癌细胞（SW480）、乳腺癌细胞（4T1）生长以及VEGF表达，并在体内促进肿瘤形成和诱导血管形成［52-53］。近几年也有研究表明骨髓MSC-Exo 通过miRNA-16-5p 抑制增殖、迁移和侵袭并通过下调ITGA2促进结直肠癌细胞的凋亡［54］；脂肪MSC-Exo通过激活Hippo信号通路促进乳腺癌细胞（MCF-7）生长和转移［55］；骨髓MSC-Exo 介导miRNA-193a-3p，miRNA-210-3p 和miRNA-5100的转移可通过激活STAT3信号转导，诱导EMT 促进肺癌细胞的侵袭［56］；骨髓MSC-Exo 携带miRNA-126-3p通过靶向ADAM9抑制胰腺癌的发展和转移［57］。

3 结语

关于MSCs及MSC-Exo对肝癌的作用，近年来一直是研究热点。目前通过编辑MSC-Exo作用于肝癌的研究结果表现出其用于治疗肝癌的光明前景，但详细的作用机制尚未完全阐明。另外关于MSC-Exo的分离纯化目前并无非常完善的方法，即使是通过超速离心获得的外泌体，其纯度也只有78.2%，试剂盒中最佳的凝胶排除策略仅为28.1%［67］，细胞分泌的外泌体的详细调控机制目前仍不清楚。MSC-Exo 虽然是良好的天然载体，但如何将抗肿瘤药物或基因等物质高效加载到外泌体内仍然是亟需解决的技术问题之一。MSC-Exo 用于治疗肝癌等疾病的作用剂量及途径等也尚无统一标准，也无相关临床试验，所以其临床运用安全性和有效性还有待验证。相信随着这些问题的解决，在未来关于肝癌的靶向治疗，MSC-Exo将会发挥重要的作用。