肾茶黄酮通过ERK/CT-1通路治疗急性肾衰模型鼠氧化应激的实验研究

2020-11-20郭银雪葛平玉胡茂蓉

世界中医药 2020年18期

郭银雪葛平玉胡茂蓉

摘要目的：观察肾茶黄酮对急性肾衰（Acute Renal Failure，ARF）模型鼠氧化应激水平的干预效应，同时观察其对ERK/CT-1通路的影响。方法：将36只急性肾衰模型大鼠随机分为模型组和肾茶黄酮观察组，每组18只，另设假手术组18只。连续肾茶黄酮干预7 d后比较各组大鼠肝肾功能、丙二醛（MDA）含量及超氧化物歧化酶（SOD）活性、肾组织ERK、p-ERK、CT-1水平的变化。结果：肾茶黄酮可明显降低ARF模型鼠肾质量、肾质量/体质量，改善大鼠肝大和鼠蛋白尿、血浆肌酐、尿素氮水平，减少MDA含量，上调SOD活性，增加肾组织p-ERK、CT-1水平。结论：肾茶对急性肾衰有明显治疗作用，可能通过ERK/CT-1通路介导肾保护效应。

关键词急性肾衰;模型鼠;氧化应激;MDA;SOD;ERK;CT-1

Abstract Objective：To observe the intervention effects of kidney tea flavonoids on oxidative stress in rats with acute renal failure（ARF）and its effect on ERK/CT-1 pathway.Methods：A total of 36 rats with acute renal failure were randomly divided into a model group（n=18），and a kidney tea flavonoid treatment group（n=18）and a sham operation group（n=18）.The changes of liver and kidney function，malondialdehyde（MDA）content，superoxide dismutase（SOD）activity，renal tissue ERK，p-ERK and CT-1 levels were compared after continuous kidney tea flavonoids intervention for 7 days.Results：Kidney tea flavonoids could significantly reduce the kidney weight and kidney weight/body weight of ARF model rats，improve the levels of proteinuria，plasma creatinine and urea nitrogen，reduce the content of MDA，increase the activity of SOD and increase the levels of p-ERK and CT-1 in renal tissue.Conclusion：Kidney tea has obvious therapeutic effects on acute renal failure，which may be mediated by ERK/CT-1 pathway.

Keywords Acute renal failure; Model mice; Oxidative stress; Malondialdehyde; Superoxide dismutase; ERK; CT-1

中圖分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.18.006

急性肾衰竭（Acute Renal Failure，ARF）是临床常见疾病，肾小管上皮细胞由于各种原因引起细胞的缺失或死亡是导致ARF发生的重要原因[1-2]。有研究显示在缺血缺氧状态下肾脏组织会产生过量的氧自由基，不但会导致酶活性蛋白质的功能受损，而且还可攻击核基因转录过程影响细胞表型，导致肾脏细胞发生过度凋亡而影响肾功能[3-4]。因此我们推断，某种干预措施如果可改善氧化应激状态，则可减轻ARF肾损害。有研究显示ERK/CT-1通路与机体氧化应激状态密切相关，激活该通路活性可缓解氧化应激引起的细胞凋亡。

肾茶又名猫须草，肾茶黄酮为中药肾茶的主要提取物，味苦、凉。目前大量研究资料[5-7]均证实肾茶黄酮可明显增加肾小球数量，改善肾小管组织形态，减轻ARF的肾损害程度，但其作用机制目前尚无统一定论，因此我们进行动物模型实验，以期进一步探讨肾茶改善ARF的作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 66只雄性清洁级级Sprague Dawley（SD）大鼠，体质量（220±109）g，鼠龄（58±2）d。所有大鼠贵阳医学院提供实验动物中心提供，所有大鼠均接受同批次标准饲料喂养，实验均在每日上午8：00-11：30时间段进行，保持环境安静、通风，温度（22±2）℃，相对湿度（55±2）%。各组大鼠在体质量、鼠龄等方面经统计学分析，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.1.2 药物肾茶，又名猫须草，样本购自衡阳森本生态农业科技发展有限公司（注册号：430400000079085，批号：892834），总黄酮由贵阳中医学院按照标准进行提取。提取方法：取10 g肾茶，加入100 mL饮用水后置于微波炉内加热至彻底沸腾后进行循环提取120 min，充分过滤后收集药液，随后加80 mL于药渣中，再次置于微波炉内加热至彻底沸腾后进行循环提取120 min，充分过滤后收集药液，后将2次提取的药液浓缩至浸膏[1.26～1.45（70 ℃）]，后将浸膏烘干、打磨成细粉，最终形成肾茶提取物（浓度为每1 g肾茶提取物相当于4.7 g生药），密封储存。

1.1.3 试剂与仪器 ERK一抗抗体（CST公司，美国，货号：4695T）、p-ERK（CST公司，美国，货号：4370T）、β-actin一抗（CST公司，美国，货号：3700T）、MDA ELISA试剂盒（上海科敏生物科技有限公司，货号：KB2925）、SOD ELISA试剂盒（上海科敏生物科技有限公司，货号：E-EL-R0929）。涡旋振荡仪（上海珂淮仪器有限公司，型号：M392）;蛋白电泳及转膜系统（Bio-Rad公司，美国，型号：B7483）;台式高速离心机（Eppendorf，德国，型号：5430）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备分组：健康生长1周后，将实验动物随机分为假手术组，模型组和肾茶黄酮观察组，每组18只。造模方法：术前禁食6 h并称重，用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉SD大鼠（0.4 mL/100 g）后，使大鼠仰卧位固定于手术台上，腹部备皮后以碘伏消毒液局部消毒，暴露手术区域。沿腹正中线纵行切口打开腹腔，用生理盐水浸湿的无菌纱布牵开腹腔脏器，先暴露右肾，以1号泰丝线分别结扎整个肾蒂和右输尿管并切除右肾;游离左肾，用无创伤动脉夹夹闭左肾动脉，并开始计时，观察左肾颜色：由红润变为苍白表示夹闭有效。1 h后松夹恢复左肾灌注，此时肾脏颜色恢复红润，提示再灌注成功。观察术野无出血和渗血后逐层缝合关闭腹腔，用碘伏消毒液再次消毒伤口后肌肉注射青霉素（6万U/100 g）2 d。假手术组仅切除右侧肾脏后关腹。

1.2.2 给药方法肾茶黄酮组于再灌注24 h后开始腹腔注射肾茶黄酮配比液2 mL（用0.9%生理盐水稀释，生药量为0.1 g/1 mL），2次/d。空白组及模型组大鼠接受2 mL生理盐水干预。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 肝、肾功能检测干预结束后随机选取3只/组大鼠，心脏采血4 mL，注入10 mL离心管中，予低速离心机（3 000 r/min）中，离心半径5 cm，离心10 min分离血清，低温保存，全自动生化仪及时检测。

1.2.3.2 用免疫组化法测定各组肾组织CT-1水平变化常规脱蜡水化，一抗为兔抗大鼠CT-1抗体（1∶50稀释），二抗为生物素化羊抗兔IgG（1∶100稀释），以PBS代替一抗作阴性对照，DAB显色，胞质呈棕黄色或棕褐色颗粒的细胞为阳性表达细胞，光镜观察阳性信号。应用图文分析报告系统在大鼠病变区域随机采集10个视野（×200倍），每個视野计数100个细胞，总计1 000个细胞，计算出平均阳性率，以百分率（100%）表示阳性细胞数，即得。

1.2.3.3 用ELISA检测法测定各组外周血MAD、SOD水平变化于最后1 d干预结束后每组随机抓取3只大鼠，取其腹主动脉血5 mL，高速离心后取出上清液，用相应的ELISA试剂盒对各组细胞的MAD、SOD水平进行检测，具体步骤如下：将样本加入ELISA反应孔板中，4 ℃过夜。第2天弃去孔内溶液，加入PBS洗涤2次，3 min/次，同时设置空白对照孔，再加入的酶标抗体的酶标抗体，室温下孵育1 h后加入PBS洗涤2次，3 min/次。反应结束后先后于空中加入0.1 mL的TMB及0.05 mL的2M硫酸，最后用酶联免疫检测仪测定各孔的吸光值（OD值）。操作过程完全按照说明书进行。

1.2.3.4 用Western Blot测定各组中肾脏组织ERK、p-ERK水平变化于最后1 d干预结束后每组随机抓取3只大鼠，充分麻醉后处死，取中缝背核组织200 mg加1 mL裂解缓冲液，4 ℃，15 000 r/min，离心5 min，离心半径10 cm，冰浴中超声，20 s/次，间隔20 s，共5次，1 h取上清，取25 μL测蛋白含量。BCA法测蛋白浓度，用凝胶加样缓冲液将各管蛋白浓度调为一致（2 mg/mL），取20 μL样品煮沸5 min。电泳（5%浓缩胶，12%分离胶，60 V，40 mA，2.5 h）结束后将凝胶取出，进行转膜，遵循胶在负极，膜在正极的原则，100 V，250 mA，时间依据各指标分子量大小而定，将硝酸纤维素膜取出，用丽春红对固定于硝酸纤维素滤膜上的蛋白质进行预染，看电泳带是否清晰，证实蛋白质确实转移到膜上。5%脱脂奶粉封闭2 h，TBST洗3次，5 min/d，分别加入抗ERK、p-ERK、β-actin一抗抗体孵育，4 ℃过夜TBST洗2次，5 min/次，加入辣根过氧化物酶标记与一抗相抗的二抗IgG（1∶2 000）室温50 min，TBST洗3次，5 min/次。将滤膜放人配好的显色液中反应1 min，计算机扫描图像，并由生物图像分析系统（Bio-Rad公司，美国，型号：Model Gel Doc 2000）分析处理。

1.3 统计学方法采用SPSS 22.0统计软件对研究数据进行统计分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，采用t检验;计数资料用百分比（%）表示，采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肾质量、肾质量/体质量的变化比较与假手术组比较，造模组大鼠肾质量、肾质量/体质量均明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较，肾茶黄酮观察组肾质量、肾质量/体质量均明显下降，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 各组大鼠蛋白尿、肾功能变化比较对各组大鼠24 h蛋白尿及肾功能指标进行检测，结果显示接受ARF模型制备的大鼠蛋白尿、血浆肌酐、尿素氮水平明显增加，与假手术组比较，差异有统计学意义（P<0.05），经肾茶黄酮治疗后大鼠蛋白尿、血清肌酸酐和尿素氮含量显著减少，与模型组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.3 各组大鼠血脂水平变化比较与假手术组比较，经过ARF模型制备后大鼠血浆总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇均明显下降，差异有统计学意义（P<0.05），与模型组比较，肾茶黄酮观察组上述指标均明显下降，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。

2.4 各组大鼠氧化应激水平变化比较与假手术组比较，经过ARF模型制备后大鼠SOD活性明显下降，MDA含量明显升高，差异有统计学意义（P<0.05），经过肾茶黄酮治疗后大鼠SOD水平上调，MDA表达下降，与模型组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。见表4。

2.5 各组大鼠中肾脏组织ERK、p-ERK、CT-1水平变化比较经过Western Blot检测可知各组大鼠肾脏组织ERK/β-actin比值相仿，差异无统计学意义（P>0.05），与假手术组比较，经过ARF模型制备后大鼠肾脏组织p-ERK、CT-1水平下降，差异有统计学意义（P<0.05），经过肾茶黄酮治疗后大鼠p-ERK、CT-1表达上调，与模型组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。见图1、图2、表5。

3 讨论

ARF是目前备受关注的公共健康问题，一旦ARF控制不理想将出现病情急速恶化，甚至引发其他系统的严重并发症。肾切除是目前较为符合人类ARF病理变化的动物模型，在本研究中我们发现造模大鼠的肾脏在术后明显增大，这可能与肾脏组织缺血缺氧后肾小管上皮细胞变性坏死，导致其基底膜连续性受破坏，产生断裂，由此肾小管内液反流至间质，从而出现肾间质性水肿，从而引起肾脏体积变大[8-9]。氧化应激是CRF的已知特征，其中SOD及MDA是目前最具代表机体氧化应激水平的指标。SOD广泛分布于生物体内，其中肾脏尤为凸显，是清除氧自由基的主要酶类物质。MDA是脂质过氧化作用后的产物，其水平高低直接标志机体氧自由基水平。大量动物模型实验证实，SOD及MDA和ARF疾病发生发展关系密切，过度表达的氧自由基通过脂质过氧化作用对肾小球产生损害作用，而脂质过氧化作用又是激活纤维细胞产生胶质的生物过程，从而导致机体肾小球系膜区的胶原分泌增多致沉积，导致肾间质纤维化产生，破坏了肾组织的正常结构及形态，影响了肾功能的正常运行。肾脏局部组织中固有细胞及浸润细胞分泌过量的氧自由基，且抗氧化酶如SOD浓度下调，从而出现氧自由基与抗氧化物酶之间的动态平衡受破坏，从而逐渐产生了上述ARF的病理改变，因此调节氧自由基在肾组织局部的生成及消除平衡是治疗ARF的关键[10-12]。

肾茶乃猫须草之别称，药理学分析证实其含有迷迭香酸、迷迭香酸乙酯、熊果酸等化学成分[13-15]。中医角度认为肾茶味苦性含寒凉，是清热解毒、利尿止血之良品，现代药理学亦证实其有明显改善肾功能的作用。BUN和Scr是临床广泛应用于衡量肾功能的重要指标，BUN主要由肝脏合成，肾脏排泄，与肾小球滤过率密切相关;血浆Scr由肌组织中磷酸肌酸分解产生，亦由肾脏排泄，在一定程度上亦体现了肾小球滤过率，故BUN及Scr均是间接体现肾脏损伤程度的重要因子。本研究通过动物模型证实肾茶确可明显减少蛋白尿的释放，降低BUN及Scr的水平，这充分说明肾茶可明显改善肾功能，与国内外诸多文獻结果一致[16-18]。

有研究显示在缺血缺氧状态下肾脏组织产生大量的氧自由基会攻击肾脏组织细胞的脂质、DNA遗传物质以及蛋白质等大分子，从而导致肾脏组织细胞过度凋亡。有资料[19]显示在机体缺血缺氧状态时CT-1可发挥反馈性保护效应，一旦ERK/CT-1通路被抑制则导致机体对抗氧化性损害的能力减弱，导致细胞过度凋亡，影响细胞活性。本研究显示造模大鼠的肾脏组织的ERK/CT-1通路标志性因子的表达被抑制，经过肾茶干预后大鼠的p-ERK及CT-1表达均上调，因此我们有理由相信肾茶可通过激活ERK/CT-1通路而实现保护ARF机体的肾功能。

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