基于UPLC-MS/MS大鼠体内白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的药代动力学参数研究*

许玲玲，姚兆敏，汪电雷，周媛媛，张 敏，李晨辉，仰忠华，赵亚男,3△

（1.安徽中医药大学药学院， 安徽 合肥 230012；2.安徽仙寓山农业科技有限公司，安徽 黄山 245000；3.皖南医学院第一附属医院弋矶山医院，安徽 芜湖 241001）

白术（Atractylodes macrocephala Koidz.），菊科多年生草本植物，根茎入药，主产于浙江、江西、湖南、安徽等地，有於术、浙东术、江西术、平江术、祁术之称[1]，多以产地命名。性温，味苦、甘，归脾、胃经，具有健脾益气、利水祛湿的功效[2]。白术中主要化学成分为倍半萜类、多炔类、多糖等，其中倍半萜类中白术内酯类具有显著的抗肿瘤[3]、抗炎[4-5]和神经保护作用[6]。白术内酯I可剂量依赖性地抑制NO、TNF-α、IL-6的产生，对慢性炎症有较强的抑制作用[2]。白术内酯II和III能够增强唾液淀粉酶活性和改善胃肠道运动功能[7-8]，具有健脾和调节紊乱肠道菌群的作用，符合临床应用白术健脾的药理活性机制。

白术内酯I、II、III是白术化学成分与药效密切相关的指标性成分，为了研究白术内酯类化合物的药理活性机制，本文就文献报道的方法进行改进[9-14]，采用UPLC-MS/MS法同时检测白术内酯I、II、III的含量，考察其在大鼠体内的药动学变化趋势，旨在为其体内药物代谢动力学过程提供初步参考，以期为白术的临床合理应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂 白术（Atractylodes macrocephala Koidz.），产于安徽祁门，经安徽中医药大学生药系金传山教授鉴定为菊科白术的干燥块茎。药材前处理：白术，除去表面污泥，晒干，并清理多余的须根。置于35℃恒温干燥箱中干燥48 h，切片，打粉过3号筛，备用。取白术粉末300 g，加入3 000 mL蒸馏水，先浸泡30 min，保持微沸30 min，药液移至旋转蒸发仪中，T=60℃，n=40 r/min，浓缩至一定体积，得到浓度为 0.84 g/mL的白术药材提取物。白术内酯I、II、III（武汉中标科技有限公司，批号分别为：73069-13-3、73069-14-4、73030-71-4，纯度：≥98%）；对乙酰氨基酚（中国药品生物制品检定所，批号：100018-200408，纯度 ≥ 98%）；乙腈、甲醇（色谱纯）；超纯水（自制）；其他试剂均为分析纯。

1.2 实验动物 SPF级SD雄性大鼠，体质量（180±20）g，购自安徽医科大学实验动物中心，合格证号：SCXK（皖）2019-002。实验前大鼠适应性饲养1周，标准温度（25±2）℃，相对湿度 40%～55%，自由摄食摄水。给药前禁食12 h，自由饮水。本文涉及的动物实验经安徽中医药大学动物伦理委员会批准。

1.3 仪器 Acquity UPLC超高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Xevo G2QTOF质谱仪（美国 Waters公司）；A2004型十万分之一电子天平（德国Sartorius公司）；Milli-Q Gradient A10超纯水器（Millipore Inc.USA）；Centrifuge 5804R台式高速离心机（上海东兢电子有限公司）；HK-2016切片机（湖北海阔医疗科技有限公司）；LK-400B型打粉机（浙江温岭创新药材器械厂）；202-2型电热恒温干燥箱（上海实验仪器有限公司）；AS5150A型超声清洗仪（Autoscience公司）；YRE201D旋转蒸发器（巩予予华仪器有限公司）。

表1 白术内酯I、II、III的结构式

1.4 方法

1.4.1 色谱条件 Waters ACQUITY UPLC CSH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱温：25 ℃；进样量：2 μL；体积流量：0.2 mL/min；运行时间：55 min；检测波长：240 nm。流动相：0.05%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱：0～19 min，25%～54%B；19～30 min，54%～56%B；30～40 min，56%B；40～50 min，56%～65%B；50～60 min，65%～25%B。

1.4.2 质谱条件 质谱离子源为电喷雾离子化源正离子（ESI+），选择多反应监测（MRM）模式，高纯氮气作为质谱用气，用于定量反应的离子和能量分别为：白术内酯 I（m/z 233.1→215.1），去簇电压 96.1 V、射入电压10.4 V、碰撞电压18.6 V、碰撞室射出电压11.0 V；白术内酯II（m/z 231.0→185.0），去簇电压103.4 V、射入电压10.0 V、碰撞电压26.8 eV、碰撞室射出电压 13.1 V；白术内酯 III（m/z 249.1→231.0），去簇电压80.0 V、射入电压10.4 V、碰撞电压13.9 eV、碰撞室射出电压16.0 V；对乙酰氨基酚（m/z 152.1→109.8），去簇电压 65 V、射入电压 10.4 V、碰撞电压20.7 eV、碰撞室射出电压11.0 V。气帘气10.0 Psi；碰撞气 9 Psi；喷雾电压 5 500 V；雾化温度550 ℃；雾化气 11.0 Psi；辅助气 0.0 Psi。

1.4.3 标准与质控样品的制备 精密称取白术内酯I、II、III对照品和对乙酰氨基酚（内标）各 1.00、1.38、1.41、1.07 mg，加乙腈溶解并定容至1 mL，得浓度分别为1、1.38、1.41 mg/mL的对照品储备液和浓度为1.07 mg/mL的内标溶液，用乙腈梯度稀释白术内酯I、II、III储备液得白术内酯 I、II、III对照品工作液，稀释内标储备液至10 ng/mL作为内标工作液，-4℃保存备用。

建立标准曲线的质控样品：50 μL空白血浆，加入25 μL内标与一定体积的对照品工作液，按下列浓度制备标准曲线：白术内酯 I、II、III分别为 1.25、2.5、5、10、30、100 ng/mL；1.725、3.45、6.9、13.8、41.4、138 ng/mL；1.765、3.53、7.06、14.12、42.3、141 ng/mL；内标溶液为10 ng/mL。空白血浆中质控样品的浓度为：白术内酯 I、II、III 分 别为 2.5、10、100 ng/mL；3.45、13.8、138 ng/mL；3.53、14.12、141 ng/mL。

1.4.4 血浆样品预处理 取血浆样品50 μL，加入内标（10 ng/mL，25 μL）；涡旋混合 30 s，加入 1 mL 乙酸乙酯萃取，涡旋混合3 min，12 000 r/min离心10 min，取上清液50 μL至新的EP管中，于35℃下N2流吹干，残渣用100 μL乙腈复溶，涡旋混合30 s，10 000 r/min离心10 min，取上清液，进样2 μL进行UPLC-MS/MS定量分析。

1.4.5 动物分组与给药 18只大鼠，灌胃给药前禁食不禁水12 h，每组6只。低、中、高剂量组分别为2.1、4.2、8.4 g/kg，一次性灌胃给药。分别于灌胃给药后的 0.083、0.17、0.25、0.33、0.5、1、2、4、6 和 12 h，眼底静脉丛采血 0.3 mL/次；采后的血浆经3 500 r/min，4℃，离心10 min，吸取上清液，-20℃冰箱冻存备用。血浆样品按“1.4.4”项下操作后进样分析，得到各个时间点的白术内酯I、II、III与内标的峰面积。

1.5 数据处理 使用LabSolutions软件进行数据采集和处理，求得血浆校正曲线并且计算每只动物的白术内酯I、II、III浓度数据；血浆药物浓度数据应用DAS 2.1药代动力学软件拟合，计算药代参数 tmax、t1/2、Cmax、AUC0-t。

2 结果

2.1 质谱分析 待测物白术内酯I、II、III及内标在ESI源正离子条件下信号强度优于负离子条件。一级全扫描模式下，待测物白术内酯I、II、III及内标分别主要生成准分子离子[M+H]+m/z 232.9、231.1、248.9、151.9。对相应的准分子离子进行二级质谱全扫描分析，待测物白术内酯I、II、III及内标进一步优化后分别选取 m/z 215.1、185.0、231.0、109.8 二级离子作为定量分析时检测的产物离子。

2.2 方法专属性 取大鼠的空白血浆，每个平行6份，除不加内标溶液外，其余按“1.4.4”项下操作，对本方法学的专属性进行考察，内源性物质不会对分析物白术内酯I、II、III及内标产生信号干扰。白术内酯I、II、III 及内标的保留时间分别为：2.55、3.1、1.8、1.2 min，见图 1。

2.3 标准曲线与灵敏性 样品经过预处理后，使用对照品建立标准曲线。取空白血浆，每个平行操作6份，分别加入白术内酯I、II、III和内标对照品工作液适量，依次测得白术内酯I、II、III和内标的峰面积，以进样浓度（X）为横坐标，峰面积比值（Y）为纵坐标，最小二乘法计算回归方程。测得回归方程为最后建立的标准曲线：白术内酯I：Y=1.447X-2.9396，r=0.9972；白术内酯 II：Y=0.9918X-3.5478，r=0.9936；白术内酯 III：Y=0.4699X-0.3463，r=0.9933；r值均大于 0.99以上，说明白术内酯 I、II、III分别在 0.1～100 ng/mL、0.138～138 ng/mL、0.141～141 ng/mL范围内线性关系良好。白术内酯I、II、III的定量下限分别为 1.25、1.725、1.765 ng/L（S/N=10）。白术内酯 I、II、III的检测限分别为 0.1、0.138、0.141 ng/L（S/N=3）。

2.4 准确度与精密度 取低、中、高3个不同浓度的白术内酯I、II、III的质控样品，每个浓度平行6次，连续进行3天，于日内和日间各测定6次，分别计算日内与日间精密度（RSD）与准确度（RE）。准确度在95%以上，日内和日间精密度均小于10%，均符合检测要求，见表2。

表2 白术内酯I、II、III的日内与日间准确度与精密度（n=6）

2.5 基质效应 取空白血浆，按“1.4.4”项下处理后，加入低、中、高3个不同浓度的对照品系列的工作液，N2流吹干后，乙腈复溶，每个浓度进样6次，记录峰面积A；另取低、中、高3个不同浓度的对照品系列工作液，N2流吹干后，乙腈复溶，每个浓度进样6次，记录峰面积B；基质效应的RSD在10%以下，表明不会对样品的分析产生明显影响，见表3。

表3 白术内酯I、II、III的基质效应（n=6）

2.6 提取回收率 取空白血浆，按“1.4.4”项下处理后，加入低、中、高3个不同浓度的对照品系列工作液，于35℃下N2流吹干，以100 μL乙腈复溶，每个浓度进样6次，记录峰面积A；另取空白血浆，加入低、中、高3个不同浓度的对照品系列工作液，同样按“1.4.4”项下处理后，于35℃下N2流吹干，以100 μL乙腈复溶，每个浓度进样6次，获得相应峰面积值B，计算提取回收率A/B（%），见表4。

表4 白术内酯I、II、III的提取回收率（n=6）

2.7 稳定性 配制低、中、高3个不同浓度的质控样品，于-20℃冰箱中冷冻1周，室温下解冻后，立即按“1.4.4”项下处理样品后，进样分析，如此重复3次冷冻与解冻过程，考察样品的3次冻融循环稳定性。24 h内重复分析低、中、高3个不同浓度的质控样品，考察样品在进样瓶内的短期稳定性。将配制好的标准样品于 -20℃冰箱中贮存，在第30天取出测定，与样品配制当天所测得的浓度比较，考察样品的长期稳定性，见表5。

表5 白术内酯I、II、III的稳定性（n=6）

图1 大鼠血浆中白术内酯I、II、III+内标的色谱图

2.8 药动学结果 白术内酯I、II、III的平均血药浓度-时间曲线见图2。白术内酯I、II、III入血吸收较快，在0.0833 h即可检测到，在血浆中可以持续12 h左右；白术内酯I、II成分的首次达峰时间点接近，都在0.5 h左右，白术内酯III成分达峰时间在1 h。

比较表6-1、6-2、6-3发现随着给药剂量的增加，大鼠体内血浆中白术内酯I、II、III的达峰浓度逐渐增加，由图3可以看出白术内酯I、II、III在大鼠体内的AUC0-t和剂量呈正相关。

图2 大鼠体内白术内酯I、II、III的药-时曲线

表6-1 低剂量组白术内酯I、II、III的药代动力学参数（n=6）

表6-2 中剂量组白术内酯I、II、III的药代动力学参数（n=6）

表6-3 高剂量组白术内酯I、II、III的药代动力学参数（n=6）

图3 大鼠体内白术内酯I、II、III的AUC0-t和剂量之间的关系

3 讨论

课题组前期已对不同产地的白术进行指纹图谱和含量测定[15]，结合实验结果对白术进行分析，综合评分发现祁门产地的白术质量明显优于其它产地。相关文献报道，白术中白术内酯类成分具有改善胃肠功能[16]、抗炎[17]和抗肿瘤[18-19]等作用，大剂量白术水煎剂能促进胃肠运动[20]，而且随着剂量的增加作用也增强。因此，本研究通过对报道的白术内酯的药代动力学检测方法进行改进，建立了一个灵敏、快速、可靠的UPLC-MS/MS法，并验证了该方法可以定量大鼠血浆中白术内酯 I、II、III的浓度。

在药代动力学实验中，对于生物样品的处理考察了乙腈沉淀蛋白和乙酸乙酯萃取两种方法，由于白术入血后的浓度极低，故选择通过乙酸乙酯萃取后浓缩复溶法处理生物样品。药动学实验结果可看出，白术内酯在5 min内即可检测到，吸收快、达峰时间长、半衰期长，AUC与剂量呈线性关系，随剂量的增大而增大。

此课题研究还存在一定的局限性，首先是药物作用机制不明确，其次是未能将白术内酯I、II、III的药代动力学与药效学相结合。白术内酯I、II、III的作用机制与发挥健脾益气功效的联系还需要进一步深入研究。