乙醇熏蒸对小白菜的护绿机理

肖婷，何欣遥，吴姗鸿，代慧，段志蓉，张敏*

1(西南大学 食品科学学院，重庆，400715) 2(食品科学与工程国家级实验教学示范中心(西南大学)，重庆，400715) 3(农业部农产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室(重庆)，重庆，400715)

小白菜茎叶可食，青翠嫩绿、鲜美爽口，富含维生素和矿物质[1]。此外，小白菜以其通肠利胃、抗癌排毒、润肤抗老的功效深受消费者青睐，素有“菜中之王”的美誉。但小白菜作为一种绿叶蔬菜，采后极易褪绿黄化，常温下仅能维持鲜绿状态1～2 d[2]，严重影响消费者的购买和食用欲望，也极大增加了商家损耗。

目前小白菜的护色保鲜技术主要有植物精油处理[3]、气调储藏[4]和1-甲基环丙烯处理[5]，然而受成本、实用性、安全性及可操作性等因素影响，这些技术的应用具有一定局限性。乙醇已在食品行业中普遍使用，其安全性被美国食品和药物管理局认可，乙醇熏蒸处理的优势是安全、经济、操作简便和处理时间短[6-7]，该技术已被成功应用于园艺产品如西兰花[8]、荷兰豆[9]、红薯尖[10]等的护绿保鲜。课题组前期研究发现,50 μL/L乙醇熏蒸处理可诱导超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和过氧化氢酶(catalase，CAT)活性，通过提升抗氧化酶活性来保持红薯尖的良好感官和较高的叶绿素含量[10]。陶炜煜[11]发现6 mL/kg乙醇处理可以提高鲜切西兰花过氧化物酶(peroxidase，POD)、CAT和SOD活性，提高酶促系统的抗氧化能力，从而抑制西兰花的呼吸强度和乙烯释放，达到较好的保绿效果。李丹等[12]用0.25、0.5和1 mL/L的乙醇处理西兰花，发现乙醇处理通过延缓黄酮含量和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除能力的下降来维持机体的抗氧化能力，从而维持西兰花的品质。宋卤哲等[6]发现500 μL/L乙醇熏蒸可提升抗氧化酶CAT活性和抗氧化物质总酚、类黄酮的含量，从而降低猕猴桃叶绿素分解速率。不少研究表明，叶绿素降解与活性氧代谢相关，活性氧清除能力过低会使得活性氧蓄积，从而加速细胞膜脂过氧化，引发膜损伤，加速叶绿素的降解[13-15]。前人研究乙醇护绿机理多集中于抗氧化水平方面，对绿叶蔬菜活性氧产生能力、清除能力与膜损伤对黄化褪绿的影响的研究未形成体系。而且，乙醇熏蒸是否对小白菜有护绿作用尚不明确。本文以小白菜为实验对象，对其进行不同浓度乙醇处理，探究乙醇对采后小白菜体内活性氧、活性氧清除系统、膜系统及小白菜色泽的影响，从活性氧方面系统的阐述乙醇护绿机理，考察不同浓度乙醇对小白菜护绿效果的差异，确定合适的乙醇剂量，为解决小白菜采后易黄化褪绿的问题提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

新鲜小白菜购于重庆市北碚菜市场，品种为重庆小水白，于2020年1月4日上午5点左右采摘，7点前运送至实验室。拣选标准：叶片和茎部完整，叶片直挺、嫩绿、有光泽，无枯黄叶、腐烂叶。

聚乙烯袋，30 cm×40 cm，厚度30 μm，石家庄诚胜塑业；泡沫箱，外尺寸40 cm×30.5 cm×20 cm，壁厚2.4 cm，成都国亨泡沫制品；95%乙醇(分析纯)，成都市科龙试剂厂；纱布，重庆北碚实验用品超市。

1.2 仪器与设备

RXZ-800B型智能人工气候箱，宁波东南仪器有限公司；U -2450PC型紫外可见分光光度计，日本岛津公司；UltraScan®PRO型测色仪，美国HunterLab公司；DDS-307A型电导率仪，上海雷磁公司；H1650R型台式高速冷冻离心机，湖南湘仪公司。

1.3 实验方法

前期实验表明每个泡沫箱内装350 g小白菜为宜。实验共设4组，熏蒸浓度分别为0(CK)、500、750、1 000 μL/L(乙醇溶液体积/泡沫箱体积)。将拣选好的小白菜放入泡沫箱，将叠放的4层纱布粘在箱盖内部中央，分别取一定体积的乙醇(体积分数95%)均匀地滴在纱布上，迅速封箱，于25 ℃室温熏蒸3 h。开箱后置于通风处30 min，再将小白菜装入聚乙烯袋，每袋(100±5) g，每组3个平行，在袋上贴好标签后封口。包装好的小白菜放入气候箱，20 ℃左右、相对湿度55%～65%条件下贮藏6 d，未对灯光进行设置，直接参考日光，每天测定指标。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 色差L*、a*、b*值

参考王羽等[16]的方法，用测色仪测定小白菜的L*、a*、b*值。L*反映明度，a*值反映红绿偏向，b*反映黄蓝偏向。每个平行随机取3棵小白菜，每棵小白菜取最外叶测定5个点，分别为主叶脉顶部1点，两侧区域各2点，最后结果取平均值。

1.4.2 叶绿素含量

参照徐芬芬等[17]的方法，用乙醇丙酮[(乙醇)∶(丙醇)=1∶1]浸提法测定，叶绿素含量按公式(1)计算：

叶绿素含量/(mg·g-1)=20.29×A645+8.05×A663

(1)

式中：A645、A663分别为645、663 nm波长处的吸光度。

1.4.3 相对电导率

参照程曦等[18]的方法进行测定，以%表示。

1.4.4 丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量

采用硫代巴比妥酸法，参考肖婷等[10]的方法，单位为μmol/g。

1.4.5 抗坏血酸(ascorbic acid,ASA)含量

采用碘酸钾滴定法[19]测定，单位为mg/100 g。

1.4.6 POD、CAT、SOD、抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)活性测定

采用分光光度计法[20-22]测定，单位为U/g。

1.4.7 还原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)含量

参照QIAN等[23]的方法用分光光度计测定，GSH和二硫代硝基苯甲酸反应生成的2-硝基-5-巯基苯甲酸在波长412 nm处具有最大光吸收。标准曲线方程为n(GSH)=80.837 9×A412+1.990 7，R2=0.998 6。根据样品管反应混合液与空白对照管显色液吸光度值的差值，从标准曲线上查出相应的GSH物质的量(n)，每克小白菜叶片中的GSH物质的量即为GSH含量，单位为μmol/g。

1.5 数据分析

采用Excel 2010处理数据；SPSS 22统计分析；显著性分析采用最低显著性差异法，P>0.05表示差异性不显著，0.01

2 结果与分析

2.1 SOD活性

图1 乙醇熏蒸对小白菜SOD活性的影响Fig.1 Effects of ethanol fumigation on SOD acti ity of pakchoi

2.2 CAT活性

图2 乙醇熏蒸对小白菜CAT活性的影响Fig.2 Effects of ethanol fumigation on CAT acti ity of pakchoi

2.3 APX活性

图3 乙醇熏蒸对小白菜APX活性的影响Fig.3 Effects of ethanol fumigation on APX acti ity of pakchoi

2.4 POD活性

POD、CAT和APX都是清除H2O2的酶[31]。如图4所示，0～4 d，POD活性不断攀升，这可能是因为贮藏前期CAT活性上升缓慢(图2)且APX活性一直降低(图3)，两者清除底物H2O2的能力有限，故机体需增强POD活性来清除H2O2。贮藏4～5 d，POD活性迅速下降，这一现象与CAT活性的变化相似，推测机体内出现了反馈抑制[32]。5～6 d，POD活性回升，也许是机体内启动了ASA-GSH循环，减轻了POD清除H2O2的负担[19]。500、750 μL/L组诱导POD活性全程高于其他2组。750 μL/L组在第3、4、6天与CK组差异极显著(P<0.01)；500 μL/L组在第3、4天与CK组差异显著(P<0.05)，第6天差异极显著(P<0.01)；1 000 μL/L组全程与CK组未形成显著性差异(P>0.05)，且第2天时POD活性低于CK组。可见，500和750 μL/L组均能有效诱导POD活性的提高，750 μL/L组提升程度更高。

图4 乙醇熏蒸对小白菜POD活性的影响Fig.4 Effects of ethanol fumigation on POD acti ity of pakchoi

2.5 ASA含量

图5 乙醇熏蒸对小白菜ASA含量的影响Fig.5 Effects of ethanol fumigation on ASA content of pakchoi

2.6 GSH含量

GSH是细胞体内关键的非酶性抗氧化物质，能参与缓冲机体内的氧化还原反应，对抗活性氧对机体的伤害[36]。如图6所示，GSH含量呈波动下降趋势。0～1 d和4～5 d各组GSH含量上升，推测是此段贮藏期间外部环境不利于小白菜贮藏，小白菜由此作出应激反应[37]。1～4 d各组呈下降趋势，结合ASA含量的变化趋势(图5)，推测此阶段GSH以自身氧化为代价促进ASA的还原再生[19]。750 μL/L组在第1天时GSH含量显著高于CK组(P<0.05)，第2、3天极显著高于其他3组(P<0.01)，750 μL/L组在维持较高的GSH含量上效果最佳。

图6 乙醇熏蒸对小白菜GSH含量的影响Fig.6 Effects of ethanol fumigation on GSH content of pakchoi

图7 乙醇熏蒸对小白菜产生速率的影响Fig.7 Effects of ethanol fumigation on superoxide anion radical production rate of pakchoi

2.8 MDA含量

图8 乙醇熏蒸对小白菜MDA含量的影响Fig.8 Effects of ethanol fumigation on MDA content of pakchoi

2.9 相对电导率

相对电导率表征细胞膜结构的破坏程度[18]，储存期间，细胞逐渐衰老，膜通透性逐渐增大。1 000 μL/L组相对电导率在贮藏初期上升幅度最大，在第1、3天显著高于CK组(P<0.05)，第2、6天极显著高于CK组(P<0.01)，可能是乙醇浓度过高加速了膜破裂[40]，加剧离子泄露。第2天开始，CK组增长幅度大幅增加，3～4 d时其相对电导率值仅稍低于1 000 μL/L组，第5天时已经高于1000 μL/L组。0～2 d，750 μL/L组与CK组、500 μL/L组未形成显著性差异(P>0.05)；3～6 d，750 μL/L组相对电导率极显著低于CK组和500 μL/L组(P<0.01)。这可能是因为750 μL/L组能够最有效地抑制膜脂过氧化，从而减弱细胞膜的破坏程度。

图9 乙醇熏蒸对小白菜相对电导率的影响Fig.9 Effects of ethanol fumigation on relati e conducti ity of pakchoi

2.10 叶绿素含量

如图10所示，随着储存时间的延长，小白菜逐渐衰老，体内的叶绿素逐渐降解，各组叶绿素含量逐渐减少。500和750 μL/L组下降趋势较平缓，CK组和1 000 μL/L组下降较迅速。1～3 d，CK组尚未与500、750 μL/L组形成显著性差异(P<0.05)；4～6 d，CK组叶绿素含量极显著低于500和750 μL/L组(P<0.01)。1 000 μL/L组叶绿素含量始终为最低值，且0～2 d与CK组差异显著(P<0.05)，4～6 d差异极显著(P<0.01)。到贮藏结束时，750 μL/L组叶绿素含量为29.54 mg/g，分别为其他3组的288.48%(CK组)、144.59%(500 μL/L组)和556.31%(1 000 μL/L组)，差异极显著(P<0.01)。适宜浓度乙醇熏蒸条件下，小白菜细胞质膜稳定性的有效维持使得位于不同空间的叶绿素降解酶和叶绿素难以接触[15]，叶绿素降解难度增加，小白菜保持更高的叶绿素含量；而高剂量乙醇加剧膜损伤，促进叶绿素降解。

图10 乙醇熏蒸对小白菜叶绿素含量的影响Fig.10 Effects of ethanol fumigation on chlorophyll content of pakchoi

2.11 色差L*、a*、b*值

如图11所示，贮藏期间小白菜L*、a*、b*值均呈现上升趋势。L*值反映明度，L*值呈现上升趋势表示小白菜在贮藏过程中逐渐变亮，500和750 μL/L组的L*值上升趋势较缓慢。a*值反映色泽的红绿偏向，a*为负值表示颜色偏向为绿色，负值越小，小白菜越鲜绿，a*值越接近零，小白菜色泽越偏离绿色。贮藏前期各组a*值差异尚不显著(P>0.05)。第2天起，1 000 μL/L组a*值迅猛增加，贮藏中期显著(P<0.05)高于其他3组，第4天时a*值已达-2.9。500和750 μL/L组整个贮藏期间a*值变化较小，750 μL/L组在贮藏前期、中期更能维持较低a*值，贮藏后期500 μL/L组更能延缓小白菜褪绿速率。贮藏结束时，500 μL/L组a*值为-6.40，750 μL/L组为-5.41，显著低于CK组和1 000 μL/L组(P<0.05)。b*值反映小白菜的黄蓝偏向，b*值为正值说明颜色偏向为黄色，正值越大小白菜越黄。图11-c显示CK组和1 000 μL/L组的b*值增长迅速，第2天后与其他2组形成显著差异(P<0.05)，说明这2组小白菜变黄速率快，乙醇浓度较低的2组可以抑制b*值的上升，延缓小白菜黄化速率。综上，500和750 μL/L组可很好的抑制L*、a*、b*值的上升，更好的延缓小白菜黄化褪绿速率。

a-L*值; b-a*值; c-b*值图11 乙醇熏蒸对小白菜色差值的影响Fig.11 Effects of ethanol fumigation on color indexes of pakchoi

3 讨论与结论

并非所有的乙醇熏蒸浓度均对小白菜有护绿效果，本研究中，1 000 μL/L乙醇熏蒸处理由于浓度过高，对小白菜的破坏能力超出其自身修复能力，不利于小白菜的采后护绿。1 000 μL/L乙醇不利于贮藏中期SOD、CAT活性和GSH含量的维持，贮藏后期ASA含量下降趋势快于对照组，活性氧代谢平衡被打破，难以维持较低的MDA含量和相对电导率，引发了膜损伤，最终加速了叶绿素的降解，难以保持鲜绿状态。