广西壮药材牛大力外源性有害物质检测分析

蒋珍藕 梁 冰 黄岛平

1.广西中医药研究院，广西 南宁 530022；2.广西中药质量标准研究重点实验室，广西 南宁 530022；3.广西分析测试研究中心，广西 南宁 530022

外源性有害物质是指中药材在生长过程中从自然环境中吸附或蓄积导致的污染，或是种植、采收加工、储运等环节不规范操作引入的污染，或是不法商贩受利益驱使对中药材(尤其是贵重药、紧俏货和饮片)采用造假、掺伪、增重、染色、漂白、熏硫磺等手段引入的污染。主要包括重金属与有害元素、农药残留、真菌毒素残留、二氧化硫残留等[1]。

重金属与有害元素(铅、镉、砷、汞、铜)进入体内后可与蛋白质、核酸等形成配合物或金属螯合物，使酶活性减弱或者丧失，影响细胞生长，进而致畸或致癌[2-3]。有机氯类农药为高残留性农药，性质稳定，毒性强，代谢缓慢，体内蓄积明显，造成慢性中毒[4-6]。黄曲霉毒素会降低机体免疫力、导致不孕、发生急性中毒等，其急性毒性甚至是氰化钾的10 倍[7]；二氧化硫对人体各脏器均有毒性，甚至致癌[8]。可见，中药外源性有害物质严重影响中药材质量和临床用药安全。

现行药典[9]和行业标准[10]已初步建立了中药外源性有害物质的控制标准体系，但与国外标准相比，检测和检查项目较少，限度要求较宽，限量标准制订进程缓慢，大部分品种仍未要求和控制，总体理念保守和滞后，造成中药外源性有害物质的控制仍处于落后水平[11]，严重阻碍中药走向世界，成为制约中药国际化的技术壁垒和瓶颈。

鉴于外源性有害物质严重影响中药质量安全、成为制约中药国际化的瓶颈，必须采取积极的措施严格控制。牛大力为广西壮药材[12-13]，既是两广地区广泛应用的著名药食两用原料，也是壮腰健肾丸[14]等近二十种中成药的主要原料；其原质量标准不完善，只有简单的性状描述，本课题组为了提高牛大力药材的质量标准，之前已对牛大力药材的显微鉴别、薄层鉴别、水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物、含量测定等内容进行了较系统的研究[15]，但对严重影响临床疗效和用药安全的外源性有害物质尚未进行考察，为此，本实验对牛大力样品中重金属及有害元素、农药残留进行检测分析，为提高完善牛大力质量标准提供实验依据，并可用于指导牛大力无公害化种植生产。

1 仪器和材料

iCAP-Q型电感耦合等离子体质谱仪(美国赛默飞公司)，Multiwave3000型微波消解仪(奥地利安东帕公司)，DS-360型石墨消解仪(广州格丹纳公司)；SCION 456-GC/TQ型气相色谱串联质谱仪(德国布鲁克公司)。

As、Cd、Cu、Pb、Hg单元素标准液均购于中国计量科学研究院，浓度为 1000 μg/mL；Li、Co、Y、Ce、Tl调谐液浓度为1 μg/L；内标为Ge、In、Bi、Li6、Sc、Tb、Y混合标准液的浓度为 10 μg/mL；有机氯对照品(α-BHC、β-BHC、γ-BHC、δ-BHC、PCNB、PP′-DDE、PP′-DDD、OP′-DDT、PP′-DDT )含量均为100 μg/mL，中国药品生物制品检定所提供。

牛大力样品的采集和购买信息见表1，均经广西中医药研究院赖茂祥研究员鉴定为豆科崖豆藤属植物美丽崖豆藤(MillettiaspeciosaChamp.)的干燥根。

表1 牛大力药材样品来源

2 实验方法和结果

2.1 重金属总量 按照《中国药典》2015年版四部通则0821重金属检查法测定。

2.1.1 标准铅溶液的制备 准确称取在105 ℃干燥至恒重的硝酸铅0.1599 g，置1000 mL量瓶中，加硝酸5 mL与水50 mL溶解后，用水稀释至刻度，摇勻，作为贮备液。精密量取贮备液10 mL，置100 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得(每l mL相当于10 μg的Pb) 。

2.1.2 供试品溶液的制备 取供试品1.0 g，按炽灼残渣检查法进行炽灼处理，然后取遗留的残渣，加硝酸0.5 mL蒸干，至氧化氮蒸气除尽后，加盐酸2.0 mL，置水浴上蒸干后加水25 mL，滴加氨试液至对酚酞指示液显中性，再加醋酸盐缓冲液(pH3.5)2.0 mL，微热溶解后，移置比色管中，加水稀释成25 mL，即得。

2.1.3 样品测定 取25 mL纳氏比色管三支，甲管中加标准铅溶液2 mL与醋酸盐缓冲液(pH 3.5)2 mL后，加水稀释成25 mL，乙管中加入供试品溶液25 mL，丙管中加入与乙管相同重量的供试品，加配制供试品溶液的溶剂适量使溶解，再加与甲管相同量的标准铅溶液与醋酸盐缓冲液(pH 3.5)2 mL后，用溶剂稀释成25 mL；在甲、乙、丙三管中分别加硫代乙酰胺试液各2 mL，摇匀，放置2 min，同置白纸上，自上向下透视。10批牛大力样品同法测定，丙管显出的颜色不浅于甲管，10批牛大力供试液显示的颜色均不比甲管深。表明10批牛大力样品中重金属总量均小于20 mg/kg。

2.2 有害元素 按照《中国药典》2015年版四部通则2321 铅、镉、砷、汞、铜测定法中的电感耦合等离子体质谱法测定。

2.2.1 仪器条件 射频功率1550 W，采样深度8 mm，冷却温度2 ℃，载气流量：1.03 L/min， 碰撞气为He气，积分时间：0.3 s，测定，数据采集重复次数3次。

2.2.2 微波消解条件 见表2。

表2 微波消解条件

2.2.3 溶液制备

2.2.3.1 调谐液的制备 直接吸取进样调谐。

2.2.3.2 内标溶液的制备 精密量取Ge、In、Bi、Li6、Sc、Tb、Y混合标准液适量，用2%硝酸稀释成200 ng/mL的混合溶液，既得。

2.2.3.3 标准曲线溶液的制备 精密量取上述标准溶液，用5%硝酸溶液稀释制成每l mL含铅2 ng、4 ng、10 ng、20 ng、40 ng、100 ng，每l mL含镉0.1 ng、0.2 ng、0.5 ng、1 ng、2 ng、5 ng，每l mL含砷1 ng、2 ng、5 ng、10 ng、20 ng、50 ng，每1 mL含汞0.1 ng、0.2 ng、0.5 ng、1 ng、2 ng、5 ng，每l mL含铜10 ng、20 ng、50 ng、100 ng、200 ng、500 ng的系列标准曲线溶液。

2.2.3.4 供试品溶液的制备 取供试品粗粉于60 ℃干燥2 h，取约0.5 g，精密称定，置耐压耐高温微波消解罐中，加硝酸10 mL。按上述消解条件进行消解。消解完全后，消解液冷却至60 ℃以下，取出消解罐，放冷，将消解液转入50 mL量瓶中，用少量水洗涤消解罐3次，洗液合并于量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得，同法制备试剂空白溶液。

2.2.4 线性回归方程 铜、砷以锗作为内标，镉以铟作为内标，铅、汞以铋作为内标，取标准系列混合溶液，进样测定，以各元素与内标计数值的比值为纵坐标，各元素质量浓度(ng/mL) 为横坐标，绘制标准曲线，线性回归方程见表3。表明各元素线性关系良好。

表3 分析元素的线性关系和检出限

2.2.5 检出限 重复测定空白溶液11次，各元素信号响应的3倍标准偏差对应的元素的浓度值即为检出限，见表3。

2.2.6 方法精密度 取牛大力药材(编号1)，用本法平行测定6次，结果各元素含量的RSD在2.3%～6.5%范围内。

2.2.7 回收率试验 取牛大力药材(编号1)约0.5 g，6份，分别加入铅500 ng、镉40 ng、砷40 ng、汞5 ng、铜2000 ng，照2.2.3.4项下制得加样回收溶液，进样测定，计算回收率，结果见表4。

表4 加样回收试验结果

2.2.8 样品测定 10批牛大力样品依法测定，计算含量。结果见表5。

表5 牛大力药材中铅、镉、砷、汞、铜测定结果 (mg/kg)

2.3 有机氯农药 按照《中国药典》2015年版四部通则2341 农药残留量测定法测定。

2.3.1 色谱条件与系统适用性试验 DB-1701 色谱柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)。程序升温：初始100 ℃，每分钟10 ℃升至220 ℃，每分钟8 ℃升至250 ℃，保持10 min。进样口温度为230 ℃。检测器温度为300 ℃。进样量1 μL。载气为高纯He气。不分流进样。在上述色谱条件下，理论板数以α-BHC峰计算应不低于1×106，两个相邻色谱峰的分离度大于1.5。

2.3.2 混合对照品储备液的制备 精密量取有机氯农药对照品溶液(100 μg/mL)各1 mL于250 mL容量瓶中，用石油醚(60～90 ℃)稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3.3 混合对照品溶液的制备 精密量取上述混合对照品储备液1 mL置10 mL容量瓶中，用石油醚(60～90 ℃)稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3.4 供试品溶液的制备 取牛大力样品细粉约2 g，精密称定，置100 mL具塞锥形瓶中，加水20 mL浸泡过夜，精密加丙酮40 mL，称定重量，超声处理 30 min，放冷，用丙酮补足减失的重量，再加氯化钠约6 g，精密加二氯甲烷30 mL，称定重量，超声处理15 min，用二氯甲烷补足减失的重量，静置使分层，将有机相迅速移入装有适量无水硫酸钠的100 mL具塞锥形瓶中，放置4 h。精密量取35 mL，于 40 ℃ 水浴上减压浓缩至近干，加少量石油醚(60～90 ℃)如前反复操作至二氯甲烷及丙酮除净，用石油醚(60～90 ℃)溶解并转移至10 mL具塞刻度的离心管中，加石油醚(60～90 ℃)稀释至5 mL，小心加入浓硫酸1 mL，振摇1分钟，离心(3000转/min)10 min，精密量取上清液2 mL，40 ℃下将溶液浓缩至适量，精密稀释至1 mL，即得。

2.3.5 线性关系和检出限考察 分别精密量取混合对照品储备液 0.5 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL置10 mL容量瓶中，用石油醚(60～90 ℃)分别制成系列浓度的混合对照品溶液；分别进样 1.0 μL，以进样量(ng)为横坐标，以相应峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，并根据信噪比3∶1的比例,计算各有机氯农药的检出限。结果见表6。

表6 9个有机氯农药成分的线性关系、定量限和检出限

2.3.6 精密度实验 取混合对照品溶液连续测定6次，结果9个有机氯农药成分峰面积的RSD在1.9%～3.2%范围内，说明仪器精密度良好。

2.3.7 稳定性实验 取混合对照品溶液，在0 h、2 h、6 h、8 h、10 h、12 h时进样测定，结果9个有机氯农药成分峰面积的RSD在1.7%～3.4%范围内，表明稳定性良好。

2.3.8 重复性实验 取同一批牛大力样品6份，按拟订的方法分别制备成供试品溶液，进样测定，结果均未检出9个有机氯农药成分。

2.3.9 加样回收实验 取重复性试验项下的牛大力样品6份，每份约2 g，精密称定，分别精密加入混合对照品贮备液2 mL，按拟订的方法测定。结果9个有机氯农药成分回收率在95.7%～106.4%范围内，RSD在2.1%～3.6%之间(n=6)。

2.3.10 样品测定 按拟订的方法测定10批牛大力样品中有机氯农药残留量，结果各批样品均未检出9个有机氯农药成分。

3 分析和讨论

10批牛大力样品中重金属总量均不超过20.0 mg/kg，符合《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》[10]中重金属总量不超过20.0 mg/kg的限量规定。

10批牛大力样品中铅、镉、砷、汞、铜测定结果见表5，均符合《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》[10]中铅含量不超过5.0 mg/kg、镉含量不超过0.3 mg/kg、砷含量不超过2.0 mg/kg、汞含量不超过0.2 mg/kg、铜含量不超过20.0 mg/kg的限量规定。

本实验农药的检出限：六六六0.01 mg/kg、滴滴涕0.02 mg/kg、五氯硝基苯0.003 mg/kg，10批牛大力样品均未检出，说明含量低或几乎不含，符合《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》[10]中农药六六六残留量不超过0.1 mg/kg、滴滴涕残留量不超过0.1 mg/kg、五氯硝基苯残留量不超过0.1 mg/kg的限量规定。

上述所检测的牛大力样品中重金属、有害元素、有机氯农药含量均较低并符合相关规定，但要制定严谨的标准还要不断监测和积累数据。中药的外源性有害物质除了种植过程中农药使用外，更多是从污染的土壤、灌溉水源及环境空气中吸收，重金属和农药在土壤中的残留时间长达数年甚至数十年。随着人工栽培药材的不断增长、种植和加工技术不断发展变化以及环境污染加重，中药材外源性有害物质的种类将会增多或变化、程度加重，因此，对中药材外源性有害物质的监测和限定标准的制定应与时俱进。

严格控制外源性有害物质势在必行。即将出版的《中国药典》2020 年版拟对植物类药材全面进行检查重金属及有害元素(铅、镉、砷、汞、铜)限度以及33种农药残留。国家中医药管理局近日发布“《中共中央国务院关于促进中医药传承创新发展的意见》重点任务分工方案”中强调：严格农药、化肥、植物生长调节剂等使用管理，分区域、分品种完善中药材农药残留、重金属限量标准。因此，①首先应完善过程控制、推动源头监管，严格控制和杜绝外源性有害物质的污染途径；②应强化技术储备、提高检测水平，提高检测方法的灵敏度、专属性、通用性、实用性及普及性；③应加强相关基础研究，充分考虑中药的使用特点、给药途径、实际监测水平等因素，科学合理地制定中药外源性污染物的限量标准。提升中药质量控制技术和安全性保障技术水平，逐步完善中药安全控制标准体系，保障中药质量和临床用药安全，突破中药国际化的瓶颈，使中药真正走向世界。