水杨酸诱导铁皮石斛抗黑斑病试验初探

卢丽蓉

（华宁县土壤肥料工作站，云南华宁 652800）

铁皮石斛为兰科石斛属植物，是一种名贵的中药材，含有石斛碱、多种人体所需的微量元素和氨基酸等有效成分，在抗肿瘤、抗氧化、提高人体免疫力、治疗胃肠道疾病等方面均有良好的效果。近年来随着人工种植面积的扩大和年限延长，病害普遍发生，其中由链格孢引起的石斛黑斑病最为严重。

水杨酸是植物体内产生的小分子酚类化合物，参与多种生理过程的调节。在植物抗病反应中它涉及并参与了植物的过敏性坏死和系统获得性抗病性反应，其诱导植物产生抗性的生理作用备受专家学者关注。因此试验用不同浓度SA处理对铁皮石斛黑斑病的诱抗效果，筛选最佳诱导浓度、最佳间隔期及持久性，为水杨酸诱导抗铁皮石斛黑斑病田间防治提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

采用铁皮石斛组培苗（壮苗生根培养3个月）；铁皮石斛黑斑病病原菌-细极链格孢为供试菌种；PCA培养基（马铃薯200 g，胡萝卜200 g，琼脂18 g，蒸馏水1000 mL）；水杨酸（SA）；聚山梨酯80。

1.2 方 法

1.2.1 铁皮石斛适应性培养

表1 不同浓度水杨酸处理对铁皮石斛黑斑病的影响比较

注：“-”表示无，同一列不同小写字母表示差异显著（p＜0.05），下同

表2 不同间隔期对铁皮石斛黑斑病的影响比

将石斛组培苗于温度25℃、光照强度1000～2000 lx，湿度70 %～80 %下培养1个月后，选择健壮、长势一致的植株试验。

1.2.2 细极链格孢孢子悬浮液的制备

将分离纯化后的供试菌种转接于PCA培养基上，于25 ℃光照（L∶D = 12∶12）的培养箱中培养14 d。用无菌水洗脱细极链格孢孢子，制成每毫升6×106个孢子悬浮液。

1.2.3 SA诱导铁皮石斛抗黑斑病的最佳浓度筛选

（1）试验处理。SA配制成每升浓度分别为0.5 mol、1.0 mol、1.5 mol、2.0 mol、2.5 mol，pH 值 接近中性加入0.05 %（聚山梨酯80）的水溶液。用喉头喷雾器将不同浓度的SA喷施于铁皮石斛叶片上（叶片正面和背面都均匀喷雾），以叶片均布、药液不流淌为度。设无菌水加0.05 %聚山梨酯80喷雾处理为对照。12 h后采用针刺法将每毫升6×106个细极链格孢孢子悬浮液（即孢子悬浮液）10 μL接种于铁皮石斛健壮叶片中部，每种浓度及对照接种10片，接种后避光保湿24 h。30 d后调查植物的病斑大小（以平均值±标准误表示，下同），计算发病率、病情指数及诱抗效果。

（2）黑斑病病斑的分级标准。

0级 针刺处无病斑；

1级 针刺处无明显病斑，病斑扩展直径小于1 mm；

2级 病斑向四周扩展直径为1～3 mm；

3级 病斑向四周扩展直径为3～6 mm，周围有轻微泛黄；

4级 病斑面积达到叶片的1/4，但小于1/2，并周围有枯黄；

5级 病斑面积大于叶片的1/2，或叶片大面积枯黄或全部枯黄。

（3）计算公式。

发病率＝（病叶数／调查总叶数）×100 %病情指数＝（∑病级叶数×该病级值／调查总叶片数×最高级数值）×100%

诱抗效果以病情指数下降百分率表示，即诱抗效果＝（对照病情指数－处理病情指数）／对照病情指数×100 %

1.2.4 SA最佳浓度处理后间隔期及抗病持久性筛选

根据SA诱导铁皮石斛抗黑斑病的最佳浓度筛选，获得SA最佳诱导浓度。将最佳浓度SA溶液加入0.05 %聚山梨酯80，喷施于铁皮石斛叶片上（叶片正面和背面都均匀喷雾），以叶片均布、药液不流淌为度。设无菌水加0.05 %聚山梨酯80喷雾处理为对照。分别于喷药后第1～10 d用针刺法将每毫升6×106个10 μL的细极链格孢孢子悬浮液接种于铁皮石斛健壮叶片中部，每种间隔期及对照接种10片，接种后避光保湿24 h。接种10 d后统计植物的病斑大小，计算发病率、病情指数及诱抗效果。

2 结果与分析

2.1 SA诱导铁皮石斛抗黑斑病的最佳浓度

由表1知，在有轻微伤口的叶片上接种细极链格孢，植株发病率接近100.00 %，病斑呈圆形或近圆形，病斑周围叶片变黄。用0.5～2.0 mmol/L 的SA处理能有效诱导铁皮石斛对黑斑病产生抗性，其中在1.0 mmol/L的 SA处理下病斑扩展最小，病情指数最低，诱抗效果达76.00 %，与对照及其他浓度处理差异显著，因此筛选出SA诱导铁皮石斛抗黑斑病的最佳浓度为1.0 mmol/L。

2.2 SA诱导铁皮石斛抗黑斑病的最佳间隔期和持久期

用1.0 mmol/L 的SA处理铁皮石斛叶片，不同间隔期对铁皮石斛黑斑病产生不同的诱抗效果（表 2）。

由表2知，SA处理1 d后接种病原菌就表现出诱抗效果，间隔5 d后接种病斑扩展最小，病情指数最低，诱抗效果达到80.00 %，与对照、间隔1 d、6 d、7d、10 d接种的病斑大小差异显著。因此，1.0 mmol/L 的SA诱导铁皮石斛抗黑斑病间隔时间以5 d为最佳。间隔10 d接种，其病斑大小与对照接近，病情指数与对照相等，诱抗效果为0.00%，表明SA诱导铁皮石斛抗黑斑病的持久期可达10 d。

3 结 论

试验结果显示，SA浓度为1.0 mmol/L处理可以达到最好的诱抗效果，同时SA最佳浓度对细极链格孢生长及孢子萌发无直接的抑制作用，表明SA是通过诱导铁皮石斛产生抗性起作用，而非SA抑制了细极链格孢的活性。试验中发现，用0.5～2.0 mmol/L的SA处理都能有效诱导铁皮石斛对黑斑病产生抗性，而2.5 mmol/L的SA处理后，病情指数与对照相等，诱抗效果为0.00%，因此SA诱导铁皮石斛抗黑斑病的浓度并不是越高越好，高浓度的SA不但不能提高植物的抗病性，反而使植物更容易感病，这与王媛的研究结果是一致的，王媛用10 mmmol/L的SA喷施拟南芥叶片接种灰霉菌后8 d，其发病率和病情指数都高于对照。所以同植物正常的抗病性一样，诱导抗性产生如果处理不当，也会产生负面作用。

用1.0 mmol/L的SA处理铁皮石斛植株，分别于喷施后第1～10 d（每天）接种细极链格孢，接种10 d后记录病情，结果显示SA处理1d后接种病原菌就表现出诱抗效果，并在1～9 d的测定时间内都表现出对黑斑病的抗性，说明SA诱导铁皮石斛抗黑斑病具有很好的持久性。其中间隔5 d接种的病斑扩展最小，病情指数最低，诱抗效果达到80.00%。表明诱导抗性的产生需要一定时间，喷施水杨酸后，只有当寄主体内某些代谢发生变化后，或某种“信息”传导后，植物才表现出对病害的抗性。因此在铁皮石斛黑斑病田间防治中，建议在病害发生之前就喷施水杨酸，这样才能起到良好的防治效果。