渭南地区奶牛养殖场生鲜乳中金黄色葡萄球菌污染状况的调查

王韦华，王录军，魏 恒，吴奇强，白 鸽，郭抗抗

(1.渭南职业技术学院, 陕西 渭南 714026；2.渭南市动物疫病预防控制中心,陕西 渭南 714000; 3.西北农林科技大学 动物医学院, 陕西 杨凌 712100)

牛乳是人类重要的营养食品，生鲜乳的卫生质量关乎人类食用安全。细菌污染是影响生鲜乳卫生质量的主要问题，特别是食源性致病菌，如金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的危害尤为严重，在我国被列为生鲜乳及其制品中微生物检测的主要对象[1]。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, SA)是一种人兽共患病原菌，在一定条件下引起人和动物发病，由于其在生长繁殖过程中可产生肠毒素，也是引起人食物中毒的主要微生物之一[2]。生鲜乳具有丰富的营养成分也是细菌良好的培养基，如果受到细菌污染后会迅速发生变质或细菌在繁殖过程中产生有害物质，对消费者健康造成直接的危害[3]。对国内外生鲜乳中金黄色葡萄球菌的污染调查发现，其污染状况存在较大差异，王文博等(2016)对山东省2个地市采集的生鲜牛乳进行检测发现，金黄色葡萄球菌的阳性率达到55.26%[4]；何源等2012年对重庆市生鲜牛乳的检测发现SA的阳性率为21.67%[5]；李希强等(2017)对来自内蒙古的生鲜牛乳检测发现SA阳性率为14.7%[6]。这些研究表明，生鲜牛乳中SA的污染在不同地区存在差异，主要和奶牛场的生物安全措施、卫生措施、挤乳方式和储存运输等过程密切相关。金黄色葡萄球菌污染生鲜牛乳一般有两条途径:一是奶牛感染金黄色葡萄球菌，乳中将会存在细菌，即内源性污染(一次污染)；二是在挤乳、保存、运输等过程中卫生状况不良，受到细菌污染(二次污染)。

我国奶牛养殖模式主要有规模化养殖场、奶牛养殖小区和散养户等，受经济发展水平的影响，不同地区奶牛养殖规模和生鲜乳的销售方式也存在较大差别。一些养殖小区和散养户对生鲜乳进行直接面向消费者销售，也对食用安全带来隐患。

渭南市是陕西省奶牛养殖比较集中的地区，截止2019年底，全市奶牛养殖规模69 900头。养殖模式有规模化牛场、养殖小区和农户散养，对生鲜牛乳中金黄色葡萄球菌的污染状况调查较少。笔者研究对渭南地区奶牛养殖场生鲜牛奶中金黄色葡萄球菌的污染状况进行调查，在奶牛养殖场分别调查牛场性质、环境卫生、挤奶前的准备工作、挤奶方式与生鲜奶盛装运输等工作，结合乳样中金黄色葡萄球菌的检出情况，分析以上因素对乳中金黄色葡萄球菌污染的影响，为保障生鲜牛乳卫生和食用安全提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 细菌和试剂

金黄色葡萄球菌标准菌株(ATCC 29213)，由西北农林科技大学动物医学院兽医公共卫生与食品安全实验室保存；牛源大肠埃希菌、沙门氏菌、无乳链球菌、铜绿假单胞菌，均由西北农林科技大学动物医学院兽医公共卫生与食品安全实验室分离鉴定并保存。细菌基因组DNA提取试剂盒购自TIANGEN BIOTECH(北京)公司；7.5%NaCl肉汤、Baird-Parker琼脂、MH肉汤、生化反应管；2×Taq MasterMix购自康为世纪生物科技有限公司；DNA Marker DL2000，购自北京全式金生物技术有限公司；EB、溶菌酶、RNase A，购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 乳样采集与处理

2019年3-4月份，选择渭南市临渭区、高新区、经开区的14个奶牛养殖场(1个规模化奶牛养殖场、2个养殖小区、11个奶牛养殖户)作为调查对象。从3月12日至4月24日，分7次从以上牛场采集乳样，每次从奶桶中采集混合乳样1份，共得到98份乳样。对样品进行标记后低温保存带回实验室进行检测。

1.3 奶牛养殖场生鲜乳生产影响因素的确定

生鲜乳的细菌污染与养殖场环境、养殖方式、挤奶前的卫生处理、挤奶方式及鲜乳盛装运输等环节密切相关。在对14个养殖场基本情况调查的基础上，将牛场规模(A)、饲养和环境消毒(B)、挤乳前处理(C)、挤乳方式(D)、生鲜乳储运和销售(E)等作为分析细菌污染生鲜乳的关键考察点。具体考察内容见表1。

表1 生鲜乳卫生状状况影响因素考察表

1.4 乳样中金黄色葡萄球菌的PCR检测

1.4.1 金黄色葡萄球菌三重PCR检测方法的验证 取金黄色葡萄球菌(ATCC29213)、大肠埃希菌、沙门氏菌、无乳链球菌、铜绿假单胞菌的菌悬液各1 mL，按照TIANamp细菌基因组DNA提取试剂盒说明书程序提取DNA。以本项目组建立的金黄色葡萄球菌三重PCR方法[7]，对以上细菌DNA进行检测，验证方法的特异性。

反应体系(20 μL)：包括ddH2O 5.0 μL，2×Taq MasterMix 10.0 μL，Primer F-SEA及Primer R- SEA各0.4 μL，Primer F-NUC及Primer R- NUC各0.7 μL，Primer F-BLAZ及Primer R-BLAZ各0.9 μL，DNA模板1.0 μL。PCR反应条件为：94℃ 2 min，94℃ 30 s，61℃ 30s，72℃ 30s，35个循环；72℃延伸7 min。

1.4.2 乳样中细菌DNA的提取和检测 取50 mL离心管，加入5 mL乳样，再加入无水乙醇1 mL、氨水1 mL和石油醚1 mL，混合均匀。混合物在4℃下，12 000 r·min-1离心l0 min，弃去上清液，然后向沉淀中加入1 mL 70%乙醇，混匀，按TIANamp细菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行DNA的提取，置-20℃条件保存。

用建立的PCR方法，对从渭南地区采集的98份生鲜牛乳样品中金黄色葡萄球菌进行检测，以金黄色葡萄球菌悬液原液DNA作阳性对照，ddH2O作阴性对照。

1.4.3 金黄色葡萄球菌的分离鉴定 将经PCR检测为金黄色葡萄球菌阳性的乳样，按照GB 4789.10-2016中规定的金黄色葡萄球菌检测方法，先在7.5%NaCl肉汤中增菌培养后，将增菌后的培养物，分别划线接种到Baird-Parker平板和高盐甘露醇培养基琼脂平板，36℃±1℃培养24～48 h。观察菌落形态和染色镜检，对可疑菌落做金黄色葡萄球菌PCR检测。

1.5 奶牛养殖场生鲜乳生产影响因素与金黄色葡萄球菌污染的相关性分析

对14个养殖场的规模(A)、饲养和环境消毒(B)、挤乳前处理(C)、挤乳方式(D)、生鲜乳储运和销售(E)等进行统计分析，明确以上因素对生鲜乳金黄色葡萄球菌污染的相关性。

2 结果

2.1 金黄色葡萄球菌PCR检测方法的验证

分别以金黄色葡萄球菌标准菌株、大肠埃希菌、沙门氏菌、无乳链球菌、铜绿假单胞菌的DNA为模板，用建立的以SEA、BLAZ和NUC基因为检测对象的三重PCR进行扩增。凝胶电泳结果显示，在金黄色葡萄球菌标准株DNA中出现3条带，分别为NUC基因(124 bp)、SEA基因(248 bp)、BLAZ基因(308 bp)；在其他细菌DNA中未有扩增产物，说明建立的方法特异性良好，可用于金黄色葡萄球菌的检测(图1)。

2.2 乳样中金黄色葡萄球菌的检测

2.2.1 乳样中金黄色葡萄球菌的PCR检测 用检测金黄色葡萄球菌三重PCR方法对提取的乳样中DNA进行检测，对PCR产物凝胶电泳观察发现在10份乳样中出现金黄色葡萄球菌特异性条带，判定为金黄色葡萄球菌阳性(阳性率10.2%)。部分样品的检测电泳图见图2A和2B。

2.2.2 PCR阳性乳样中金黄色葡萄球菌的分离鉴定 按照国标方法对经PCR检测为金黄色葡萄球菌为阳性的乳样进行细菌的分离，在高盐甘露醇培养基琼脂平板上可见到圆形、光滑凸起、湿润、金黄色的菌落(图3A)，在Baird-Parker平板上呈圆形，表面光滑、凸起、湿润、灰黑色至黑色，有光泽的菌落(图3B)。对疑似金黄色葡萄球菌进行革兰氏染色、镜检，可见到分离菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽胞，无荚膜，直径约为0.5～1 μm(图3C)。对分离的疑似金黄色葡萄球菌进行PCR检测，结果表明可扩增得到特异性的条带(图3D)，说明分离菌为金黄色葡萄球菌。从PCR阳性的10份乳样中分离到金黄色葡萄球菌。

2.3 采样奶牛场与鲜乳生产相关影响因素调查结果

对14个养殖场的规模(A)、饲养和环境消毒(B)、挤乳前处理(C)、挤乳方式(D)、生鲜乳储运和销售(E)等进行统计分析。结果表明：①养殖场的规模(A)：2个采样点为养殖小区(A1)，1个采样点为规模化养殖(A2)，其余11个牛场均属于农户小规模散养(A3)，养殖规模6～11头。②饲养和环境消毒(B)：所有奶牛场及牛舍均坚持定期消毒(B1)；多数工作人员、用具及饲养过程中随时消毒(B2)；除采样点之外，奶牛单独饲养，未与其他动物混养(B3)；所有采样点在鲜乳盛装、贮藏与运输过程中都进行消毒(B4)。③挤乳前处理(C)：多数养殖场挤奶前工作人员会穿戴工作服(C1)、洗净双手(C2)；对牛乳房会进行清洗和消毒(C3)；只有养殖小区和规模化养殖场挤奶前对乳房进行药浴(C4)。④挤乳方式(D)：大多数散养场挤乳前没有废弃头3把奶；除采样点采用人工挤奶(D2)之外，其余采样点均采用挤奶器挤奶(D1)。⑤生鲜乳储运和销售(E)：均为多个奶牛的混合奶样(E2)；养殖小区和规模化养殖场以集中销售为主(E4)，散养户均为零散销售(E3)。统计结果见表2。

表2 采样奶牛场与鲜乳生产相关影响因素调查结果

2.4 不同养殖场金黄色葡萄球菌的检测结果

本次调查主要针对不同奶牛养殖场生鲜乳受金黄色葡萄球菌污染的调查，每次采样均为奶牛场乳样混合样品，每个场每次采样1份，共采样7次(约每周采样一次)。检测结果发现，在4个养殖场的乳样中检测到金黄色葡萄球菌，7次采样样品中，金黄色葡萄球菌检测1次阳性的有1个场，2次阳性的2个场，5次阳性的1个场。具体为采样点乳品中检出率较高，达到71.43%(5/7)，采样点⑤和的检出率为28.57 %(2/7)，采样点⑥的检出率为14.29 %(1/7)，统计结果见表3。

表3 各奶牛场乳样中金黄色葡萄球菌的检测结果

对采样时间和金黄色葡萄球菌污染相关性分析显示，金黄色葡萄球菌对生鲜乳的污染与采样时间无相关性。对检出金黄色葡萄球菌的4个养殖场基本情况调查发现，均为家庭小规模养殖(奶牛头数6～9头)，挤乳后对鲜乳混合后进行零售；5次检测为阳性的牛场存在奶牛与其他动物混养、手工挤奶、挤乳前未对双手和牛乳房进行充分清洗和消毒。说明养殖环境和挤乳卫生状况对生鲜乳的卫生质量有显著影响。

3 讨论

金黄色葡萄球菌是常见的革兰氏阳性食源性细菌，主要致病因子为分泌的外毒素，如肠毒素、溶血毒素和杀白细胞素等，是引起人食物中毒的常见病原，同时也能感染人和动物而引起感染和发病。奶牛乳房炎是严重影响奶牛健康和乳品卫生质量的问题，金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎的主要致病菌，多项研究表明金黄色葡萄球菌在奶牛乳房炎发生中具有重要作用。除了奶牛感染而使乳中携带金黄色葡萄球菌外，在生鲜乳生产过程中卫生状况不良也造成污染的主要来源。Sukanya T等(2020)对日本北海道奶牛原料乳中分离的金黄色葡萄球菌的流行情况进行调查发现，在北海道的3个奶牛场采集436份无乳房炎特征的乳样，其中135份检出金黄色葡萄球菌，阳性率为30.96%[8]。范亚楠等(2015)对安徽芜湖地区的185份生鲜牛乳通过PCR方法检出金黄色葡萄球菌49株，阳性率26.5%[9]。张玲等(2019)对浙江杭州市某奶牛场99份生鲜乳中分离到5株金黄色葡萄球菌(5.1%)[10]。韩淑芳等(2016)从山西某奶牛场随机采集25份奶样，进行细菌分离培养、染色镜检、H2O2酶试验鉴定，分离出18株金黄色葡萄球菌，呈现较高的金黄色葡萄球菌污染[11]。从国内外的研究结果可以看出，不同地区、奶牛场生鲜牛乳中金黄色葡萄球菌的阳性率存在较大差异[12～16]。

我们对陕西省渭南市14个生鲜牛乳采样点的调查及检测结果分析，在4个养殖场的乳样中检测到金黄色葡萄球菌，7次采样样品中，金黄色葡萄球菌检测1次阳性的有1个场，2次阳性的2个场，5次阳性的1个场。对采样时间和金黄色葡萄球菌污染相关性分析显示，金黄色葡萄球菌对生鲜乳的污染与采样时间无相关性。对检出金黄色葡萄球菌的4个养殖场基本情况调查发现，均为家庭小规模养殖(奶牛头数6～9头)，挤乳后对鲜乳混合后进行零售；5次检测为阳性的牛场存在奶牛与其他动物混养、手工挤奶、挤乳前未对双手和牛乳房进行充分清洗和消毒。深入调查，我们也发现小规模式散养场不能定期对动物及饲养环境进行消毒，难以发现一些隐性疾病或者不合格奶样，特别是乳房炎，可能是造成牛乳污染的一个重要原因。有的奶牛场在挤乳前没有对乳房进行擦洗、消毒和药浴，也没有废弃头3把奶。个别养殖场挤乳时几乎都不药浴，会造成细菌的繁殖和相互感染。另外，用挤奶机挤奶时很难发现不正常奶样，造成混合乳样的污染等。说明养殖环境和挤乳卫生状况对生鲜乳的卫生质量有显著影响。

笔者研究表明渭南地区奶牛养殖场生鲜牛乳的金黄色葡萄球菌污染率较低，造成金黄色葡萄球菌污染与奶牛养殖环境、挤乳前的消毒工作、挤乳方式密切相关，良好的养殖环境和挤乳方式将大大降低金黄色葡萄球菌对乳的污染。