SERS-HPLC联用技术对邻氨基苯硫酚与邻碘苯甲酰氯反应的监测

张 辉，张晨杰，徐敏敏，袁亚仙，姚建林

（苏州大学材料与化学化工学部，苏州215123）

高效液相色谱（HPLC）因其高效的分离性能而广泛应用于食品安全［1］、生物［2］、医药［3］及环境保护［4］等领域.然而HPLC技术存在局限性，如难以分开极性相似的混合物，难以提供结构信息等［5］.联用技术的出现解决了这些问题，如与质谱（MS）联用定量测定食品组成、分析产物结构及产物收率等［6］.但该联用技术对于一些未知组分的结构分析仍较困难［7，8］.因此，亟待发展一种高效分离与结构鉴别的联用技术.

振动光谱可用于物质结构的鉴别.将HPLC与振动光谱技术联用可用于研究复杂多变的有机反应历程.表面增强拉曼光谱（SERS）具有高灵敏度的特点，可使信号增强10个以上数量级［9］，实现单分子检测.因此，将SERS与HPLC联用可在分离基础上实现结构鉴别.目前，该联用技术已成功用于检测生物碱［10］、农药［11］、染料［12］以及药物代谢［13］等. 近年来，我们［14］已将SERS-HPLC联用技术运用在有机反应体系中，以有序Au纳米粒子二维阵列膜为基底，实现了对苯硼酸和3-溴吡啶的Suzuki偶联反应的实时连续分离和检测，同时也检测到反应副产物联苯.温度、催化剂、溶剂和酸碱度等可能导致不同历程的有机反应.目前，SERS-HPLC联用技术主要集中在固定反应条件下有机反应体系的研究.

邻氨基苯硫酚（OATP）为含有巯基（—SH）和氨基（—NH2）的双官能团分子，—SH的存在使其易在基底吸附而被SERS检测［15］，此外，其在酰氯存在下极易形成硫酯化合物或酰胺化合物［16，17］.催化剂一方面用于改变反应的活化能，使反应速率提高，另一方面催化剂也会参与反应，如铜催化剂活化邻位的C—H/C—N环化反应中，铜催化剂与活性位点进行配位生成稳定的铜离子络合物，通过去质子化作用完成反应［18］.本文以OATP与邻碘苯甲酰氯反应为模型体系，选用具有较高可重复性的固相二维有序Au纳米粒子阵列为SERS基底，采用SERS-HPLC联用技术进行现场监测，研究该反应中的催化剂效应并解析相应的反应过程.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

四水合氯金酸（HAuCl4·4H2O，纯度99.9%）、二水合柠檬酸三钠（Na3C6H5O7·2H2O，纯度99.0%）、盐酸羟胺（NH2OH·HCl，纯度98.5%）、醋酸铜、三乙胺和邻碘苯甲酰氯（C7H4ClIO）均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；甲醇（色谱纯）购自伊诺凯科技有限公司；邻氨基苯硫酚（分析纯）购自麦克林生化科技有限公司；聚乙烯吡咯烷酮（PVP，Mw=10000，分析纯）购自百灵威科技有限公司；1，4-二氧六环（分析纯）购自艾览化工科技有限公司；实验用水为超纯水（电阻率≥18.2 MΩ·cm）.

LabRam HR800型共聚焦显微拉曼光谱仪（法国Jobin Yvon公司，激光波长为632.8 nm，到达样品的功率约5 mW，狭缝和共焦针孔均为100 μm，物镜为奥林巴斯50X长焦镜头）；UltiMate™3000型高效液相色谱仪［美国赛默飞世尔科技公司，配备自动进样器、四元泵、柱温恒温箱、Hypersil GOLD C18色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）以及可变波长紫外检测器（DAD）］；Q-TOF3型质谱仪（美国布鲁克科技有限公司）；AVANCE NEO 400 MHz液体超导核磁共振波谱仪（瑞士布鲁克公司）.

1.2 基底制备过程

参照文献［19］方法制备15 nm金纳米粒子溶液.将1 mL 1%（质量分数）HAuCl4·4H2O的水溶液稀释为0.01%的水溶液，加热至沸腾保持回流，迅速加入2 mL 1%（质量分数）柠檬酸三钠水溶液，溶液从淡黄色逐渐变为灰色及酒红色.15 min后自然冷却至室温，即得15 nm金纳米粒子溶液.

参照文献［20］方法制备30 nm金纳米粒子.取25 mL上述金纳米粒子溶液，分别加入1 mL 1%（质量分数）的柠檬酸三钠水溶液，1 mL 1%（质量分数）PVP水溶液及20 mL 25 mmol/L的NH2OH·HCl水溶液.在常温低速搅拌下，以60 mL/h的速度滴入20 mL 0.1%（质量分数）的HAuCl4水溶液，30 min后溶液由酒红色变为粉红色最后变为紫红色，即得到30 nm左右的金纳米粒子溶液.

Au纳米粒子单层膜的制备：参照文献［21］方法，取3 mL 30 nm Au纳米粒子溶液，在自制的挥发装置中于40℃下真空干燥16 h.在气液界面逐渐形成一层致密均匀的Au纳米粒子单层膜.将纳米粒子单层膜通过提拉的方式转移至干净的硅片表面，干燥后作为SERS基底待用.

1.3 醋酸铜的催化反应

向OATP（0.22 mmol）的无水1，4-二氧六环溶液中加入Et3N（0.4 mmol）. 室温下搅拌30 min后，加入Cu（OAc）2（0.01 mmol）作为催化剂，然后滴加邻碘苯甲酰氯（0.2 mmol），在110℃下反应12 h后，向溶液中加入适量饱和NaHCO3水溶液，并用乙酸乙酯萃取.产物通过柱层析分离提纯［洗脱液：n（PE）/n（EtOAc）=10∶1］. 未加Cu（OAc）2的实验用于对比研究.

1.4 SERS-HPLC联用监测

从反应体系内取0.2 mL样品，通过在采样针头处0.22 μm的过滤器滤除不溶物后，用甲醇稀释至1.5 mL，将配制好的样品置入HPLC自动进样器，用于SERS-HPLC系统检测.

2 结果与讨论

2.1 SERS-HPLC联用系统的构建

将PEEK管一端与HPLC的DAD检测器相连，另一端连接带有刻度的高压微量分流阀.设计带储液凹槽的手动旋转平台，凹槽内装有可灵活更换的修饰Au纳米粒子单层膜的硅片作为SERS基底，以便消除SERS检测的“记忆效应”.检测过程中系统流速为1 mL/min.10 μL待测液通过自动进样器注入HPLC中，具有不同保留时间的物质先后流经DAD检测器后流入拉曼光谱仪检测平台下的转盘，通过调节分流阀的流速，使流出液到达载有Au纳米粒子单层膜的硅片表面，从而快速获得SERS谱.

2.2 无催化剂条件下反应过程分析

选取OATP和邻碘苯甲酰氯为反应底物，以甲醇和水（体积比70∶30）混合溶液为流动相.首先，测定OATP标准样品的HPLC谱（图S1，见本文支持信息），观察到保留时间分别为4.2和6.4 min时的谱峰.由于—SH极易自偶联产生二硫化物而被HPLC所检测.为了验证此可能的反应产物，在标准样品中加入少量三乙胺，原保留时间为4.2 min时的吸收峰消失［图S1（B）］，其源于三乙胺使二硫化物S—S键断裂［22］.保留时间为6.4 min时的流出液的SERS与OATP光谱特征一致［图S1（C）］，由此6.4 min时的色谱峰可指认为OATP.值得说明的是，在4 min附近时仍可观察到弱峰，SERS检测时并未观察到除溶剂外的特征谱峰，判断其为溶剂峰.

图1为OATP与邻碘苯甲酰氯反应12 h后的SERS-HPLC检测结果，保留时间为12.1和15.2 min时观察到明显的色谱峰，表明反应可能生成了两种不同产物［图1（A）］.对比二者相应的光谱特征［图1（B）］，发现前者（12.1 min）在1662 cm—1处检测到C=（O）—S的C=O伸缩振动峰，在1250 cm—1处观察到归属于酰胺Ⅲ谱带的特征峰.因此，12.1 min时的色谱峰归属为硫酯类化合物.后者（15.2 min）仅观察到1500 cm—1处的峰，归属于酰胺N—H的剪式振动，以及1350 cm—1处的峰，归属于仲酰胺的C—N伸缩振动，表明15.2 min时的色谱峰归属为酰胺类化合物.

当产物中存在S—S键，其因吸附金属纳米粒子而断裂形成硫-金属键［23］，因此并未检测到该峰；对于硫酯，其中C（=O）—S的结构可能存在互变异构C（—O—）=S，C=S与Au纳米粒子相互作用，易测得硫代酯的SERS信号［24］.两种产物SERS谱中存在相同频率的特征峰，表明产物吸附在金属表面的结构相似，据此判断保留时间为12.1和15.2 min时的产物分别为双取代酰胺键的硫酯（1b）及二硫化物与酰氯生成的酰胺（2b）.

Fig.1 HPLC chromatogram of the reaction solution after 12 h without catalyst(A)and SERS spectra of the effluent at retention time of 12.1 and 15.2 min(B)

为进一步研究该反应历程，采用联用技术测定了不同反应时间内混合体系的组成.如图2（A）所示，反应初始并未观察到反应物的色谱峰，说明两种反应物混合后立即生成新物质，如在7.8 min时观察到新色谱峰，该峰强度随反应时间的增加而降低，其对应的SERS谱如图2（B）所示.图中在1250～1300 cm-1范围内观察到N—H弯曲及C—N伸缩振动相互作用的酰胺Ⅲ谱带，1370 cm-1处的谱峰归属为C—N伸缩振动，1445 cm-1处的谱峰归属为N—H的弯曲振动，此类特征峰均为酰胺Ⅱ谱带.综上可知，7.8 min时的色谱峰归属为OATP与邻碘苯甲酰氯生成的2-碘-N-（2-巯基苯基）苯甲酰胺.

Fig.2 Time⁃dependent HPLC chromatograms of the reaction solution within 1 h(A)and SERS spectra of effluent at retention time of 7.8 min(B)

图3为反应0，2及6 h后溶液的SERS-HPLC检测结果.反应起始保留时间分别为5和6 min时流出液的SERS谱如图3（B）所示，两者光谱特征相似，但并未在HPLC中检测到对应的色谱峰［图3（A）］.在8 min时流出液中检测到2-碘-N-（2-巯基苯基）苯甲酰胺的特征谱峰，反应2 h后，该色谱峰和SERS谱峰均消失，说明此物质参与反应并完全消耗.

反应2和6 h后，5，6和8 min时的流出液中未检测到除溶剂外的SERS特征谱峰，在12和15 min时对应流出液中检测到两种产物的SERS特征谱［图3（C，D）］.由此可知，反应初始阶段存在少量未被HPLC检测到的反应物，SERS因极高灵敏度而可检测这些物质的特征谱峰，随反应时间延长反应物迅速被消耗而无法观察到特征SERS谱峰.

Fig.3 HPLC chromatograms of the reaction solution after 0,2 and 6 h without catalyst(A),time⁃dependent SERS spectra of effluent after 0 h(B),2 h(C)and 6 h(D)with the interval time of 1 min

2.3 催化剂条件下反应过程分析

通常，OATP与邻碘苯甲酸甲酯反应生成苯并硫氮杂卓酮［25］，上述无催化剂实验中，比邻碘苯甲酸甲酯活性更高的邻碘苯甲酰氯未与OATP反应得到类似结构产物，于是引入醋酸铜为催化剂研究了上述反应行为，催化反应12 h后体系的SERS-HPLC检测结果如图4所示.由图4（A）可见，仅生成了保留时间为12.1 min时的产物，但与无催化剂下相同保留时间产物的SERS谱［图4（B）和图1（B）］对比，发现两者的谱峰特征存在明显差异.

Fig.4 HPLC chromatogram of the reaction solution after 12 h with catalyst(A)and SERS spectra of the effluent of 12.1 min reaction without(a)and with(b)catalyst(B)

由图4（B）可见，位于700 cm—1左右的谱峰归属为Ph-S-Ph类化合物的C—S伸缩振动，1760 cm—1处存在内酰胺的酰胺Ⅰ特征谱峰，700～900 cm—1范围内的谱峰归属为C—N对称伸缩振动，在650～700 cm—1范围内的谱峰归属为C（=O）—N的面内变形振动，由此可知，12.1 min时的流出液所含物质结构应为内酰胺类化合物.由于其SERS光谱与无催化剂条件下产物1b显著不同，通过薄层层析法判断两种物质极性时发现，产物3b极性略低于产物1b，由此可知，其结构中存在无可被取代的活性氢，在催化剂作用下的产物应为苯并硫氮杂卓酮类化合物（3b）.

考虑到提取1 h内的反应体系易造成催化剂的损失而影响反应的进行，仅对反应0和1 h的体系进行SERS-HPLC的分离检测，发现保留时间为12.1 min时的色谱峰出现明显的肩峰，其对应于两种物质.随着反应时间延长，肩峰逐渐消失，说明产物之间存在结构互变，主产物3b由产物1b经重构而成（图S2，见本文支持信息）.将初始阶段和反应1 h后流出液与标准样品的SERS光谱进行对比，表明产物3b的形成与产物1b有关（图S3和图S4，见本文支持信息）.

分别对反应0，1和6 h后的溶液进行SERS-HPLC联用检测（图5）.可见，反应0，1和6 h内保留时间5～10 min时检测到多个色谱峰，且在HPLC谱中未出峰的流出液也检测到SERS特征谱［图5（A）］；随着反应进行，检测到SERS谱峰的时间区间逐渐减少；从SERS谱图中判断仅在反应起始阶段检测到产物1b的信号［图5（B）］，反应1和6 h内在12.1 min时的流出液中仅检测到归属于产物3b的特征峰［图5（C，D）］.以上现象表明催化剂存在时，体系内首先出现多种活性物质参与反应生成了产物3b，随着反应进行，反应速率加快，活性物质逐渐被消耗，体系内的物质结构发生由复杂趋向于单一的变化，最终得到产物3b.

Fig.5 HPLC chromatograms of the reaction solution in 0,1 and 6 h with catalyst(A),time⁃dependent SERS spectra of effluent after 0 h(B),1 h(C)and 6 h(D)with the interval time of 1 min

2.4 催化剂条件下反应机理

OATP、2，2′-二硫代二苯胺先与邻碘苯甲酰氯反应分别形成酰胺化合物2-碘-N-（2-巯基苯基）苯甲酰胺及产物2b｛N，N′-［二硫（2，1-亚苯基）］二（2-碘苯甲酰胺）｝，2-碘-N-（2-巯基苯基）苯甲酰胺由于其存在游离的巯基，故存在两种反应路径：（1）光照下2-碘-N-（2-巯基苯基）苯甲酰胺形成硫自由基后经偶联生成产物2b；（2）2-碘-N-（2-巯基苯基）苯甲酰胺与另一分子的邻碘苯甲酰氯反应生成产物1b.

产物1b在醋酸铜作用下，其酰胺键与催化剂形成络合物中间体Ⅰ，邻碘苯甲氨酰基自由基离去与酰胺键反应，硫自由基与催化剂形成络合物中间体Ⅱ，邻位的碘离子受到催化剂的影响离去，而活性硫自由基进攻邻位从而生成产物3b，如Scheme 1所示.

Scheme 1 Proposed reaction processes OATP and 2⁃iodobenzoly chloride with catalyst

2.5 反应产物的核磁共振波谱分析

采用核磁共振波谱（1H NMR）和质谱（MS）（图S5，见本文支持信息）对反应产物进行验证，反应后的混合溶液通过柱层析分离获得产物.

产物1b｛S-［2-（2-碘苯甲酰氨基）苯基］-2-碘代苯硫酸盐｝为白色固体，1H NMR（400 MHz，DMSO-d6），δ：10.20（s，1H），8.02（dd，J=7.9，1.0 Hz，1H），7.94（d，J=7.9 Hz，1H），7.84～7.73（m，2H），7.70～7.53（m，3H），7.49（d，J=4.6 Hz，2H），7.42（td，J=7.6，1.4 Hz，1H），7.32（td，J=7.7，1.6Hz，1H），7.27～7.18（m，1H）.HRMS（ESI）：［M+H］+：585.8833. 产物2b｛N，N′-［二硫（2，1-亚苯基）］二（2-碘苯甲酰胺）｝为浅黄色固体，1H NMR（400 MHz，DMSO-d6），δ：10.35（s，1H），7.96（d，J=7.9 Hz，1H），7.68（dd，J=7.7，1.8 Hz，1H），7.53（d，J=4.6 Hz，2H），7.41（d，J=7.5 Hz，1H），7.38～7.21（m，3H）.HRMS（ESI）：［M+H］+：708.8979.产物3b｛10-（2-碘苯甲酰基）二苯并［b，f］［1，4］硫氮杂-11（10H）-酮｝为黄色固体，1H NMR（400 MHz，DMSO-d6），δ：7.96（dd，J=7.9，1.0 Hz，1H），7.82（dd，J=7.7，1.3 Hz，2H），7.69（ddd，J=24.1，7.9，1.3 Hz，2H），7.62～7.37（m，6H），7.18（td，J=7.7，1.7 Hz，1H）.HRMS（ESI）：［M+H］+：457.9689.

实际上，NMR测定对产物的纯度、用量及溶剂均有较苛刻要求，需要繁琐的分离提纯过程，且难以获得反应的动态变化信息，具有一定的局限性.而SERS-HPLC联用体系可直接检测混合样品，且所使用的样品浓度低（10—2～10—3mol/L），用量少（甚至可进行痕量检测），可快速获得随时间变化的反应行为.

综上所述，本文以Au纳米粒子单层膜为基底，构建了SERS-HPLC联用技术，实现了对邻氨基苯硫酚与邻碘苯甲酰氯的反应研究，无催化剂时反应生成产物1b和2b，在醋酸铜催化下生成3b.与传统检测手段相比，HPLC-SERS联用技术不需要复杂的提纯过程，样品需求量少及可连续分析，是一种快捷简便的分离检测技术，同时对反应体系内的活性物质可以快速捕获并推测其结构，为反应过程的解析提供了一种高效新技术.

支持信息见http：//www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20200379.