黄原胶对Suc-Asn反应体系中5-羟甲基糠醛形成的影响

叶 倩，徐 宁，郭红英*，秦 丹，谭兴和，王 锋，王仁才

（1.湖南农业大学 a.食品科技学院；b.园艺园林学院，长沙 410128；2.湖南省食用菌研究所，长沙 410013）

5-羟甲基糠醛（5-Hydroxymethylfural，5-HMF）纯品为针状晶体或粉末，具有甘菊花味，5-HMF易溶于甲醇、水、乙酸乙酯，可溶于氯仿、苯、乙醚，微溶于四氯化碳溶液，难溶于石油醚［1］，分子式为C6H6O3，结构如图1所示。5-HMF主要是在热加工食品（如烘焙、烧烤等）过程中产生的一种可以刺激呼吸道、眼睛、黏膜，引起皮肤过敏及肠道溃疡的有害物质［2］，虽可对食品增色调香［3］，但却具有一定的致癌性［4-5］。目前已知5-HMF的主要产生途径有3种：焦糖化反应、果糖脱水和美拉德反应［6-7］。美拉德反应和焦糖化反应是形成食品风味及感官的主要来源，但又会产生一系列对人体有毒有害的物质，如5-HMF和丙烯酰胺等物质［8］。因此，如何有效抑制5-HMF在食品热加工过程的产生至关重要。

图1 5-羟甲基糠醛的化学结构Fig.1 The chemical structure of 5-HMF

黄原胶（xanthan gum），又称汉生胶或黄杆菌胶，属于微生物胶，颜色为浅黄色或白色，易溶于水，具有稳定、乳化、胶凝等作用，常用于食品工业生产［9］。陈季旺课题组［10-12］先后研究了于外裹糊配方中添加黄原胶对油炸外裹糊鱼块的丙烯酰胺、油脂、水分等含量和感官品质的影响，试验结果表明黄原胶对油炸外裹糊鱼块的丙烯酰胺含量、色度和质构、水分蒸发和油脂吸收等均有显著影响。现有较新研究显示，5-HMF可参与丙烯酰胺的生成，其生成机理是葡萄糖在热反应条件下脱水生成3-脱氧葡萄糖醛酮（3-DG），进一步脱水生成3，4-DG和5-HMF，这些羰基化合物都可与天冬酰胺反应生成丙烯酰胺［13-14］。且多项试验报道了温度和pH值对黄原胶的流变性和黏度的影响较小［15-16］。因此本试验采用蔗糖（Suc）和天冬酰胺（Asn）为主要反应底物，建立美拉德模拟反应体系，通过改变反应条件等方法探究黄原胶对体系中5-HMF形成的影响，旨在为降低热处理食品中有害物质5-HMF的产生提供更多参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

乳酸（分析纯）购于武汉市江北化学试剂有限责任公司；5-羟甲基糠醛标准品购于SIGMA公司；蔗糖（分析纯）、L-天冬酰胺（生化试剂）、黄原胶（化学纯）、甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）均购于国药集团化学试剂有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）购于梯希爱（上海）化成工业发展有限公司。

CP214型电子天平购于奥豪斯仪器上海有限公司；VORTEX-5型漩涡振荡仪购于海门市其林贝尔仪器制造有限公司；722S型可见分光光度计购于上海菁华科技仪器有限公司；Waters e2695型高效液相色谱仪购于美国Waters公司；SHZ-DⅢ型循环水系真空泵购于巩义市予华仪器有限公司；TGW16型台式高速微量离心机购于长沙英泰仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 建立Suc-Asn反应体系

准确称取0.342 3 g蔗糖和0.264 2 g天冬酰胺于250 mL圆底烧瓶中，再加入0.5%乳酸溶液100μL和300μL不同质量浓度的黄原胶溶液，充分混合，密封后置于160℃油浴锅中反应10 min后取出，水冷却3 min，加3.0 mL超纯水，涡旋1 min，过膜（0.45μm）后待测。

1.2.2 单因素试验

按1.2.1建立Suc-Asn反应体系，以抗氧化能力、褐变度、5-羟甲基糠醛含量为优化指标，探究影响体系中5-HMF生成的因素。配方设计：1）固定反应时间10 min、黄原胶质量分数0.3%、pH值为7，考察不同反应温度（120、140、160、180、200℃）对体系中5-HMF形成的影响；2）固定反应温度160℃、黄原胶质量分数0.3%、pH值为7，考察不同反应时间（4、6、8、10、12、14、16 min）对体系中5-HMF形成的影响；3）固定反应时间为10 min、反应温度为160℃、pH值为7，考察不同质量分数的黄原胶溶液（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）对体系中5-HMF形成的影响；4）固定反应时间10 min、黄原胶质量分数0.3%、反应温度160℃，考察不同 pH 值（1、2、3、4、5、6、7、8）对体系中5-HMF形成的影响。

1.2.3 正交试验

在单因素试验基础上，确定各反应条件的影响范围，进行正交试验。

1.3 测定方法

1.3.1 抗氧化能力的测定

参照郭红英［17］和 Mohsen等［18］的方法，配制浓度为6.5×10-4mol/L的DPPH-甲醇溶液作为母液，用50%甲醇将母液稀释10倍，按表1进行反应，并于DPPH溶液的最大吸收波长517 nm测A0、Ai、Aj所表示样品的吸光度值（注：Ai所表示的样品需在室温下反应30 min后方可进行吸光度的测定）。每个试样做3个平行试验，取其平均值。

表1 DPPH试验加样（mL）Tab.1 Volumes of ingredients for DPPH test (mL)

样品对DPPH自由基的清除能力（scavenging activity，SA）表示为：

其中，A0：DPPH与溶剂混合液的吸光度；Ai：DPPH与样品反应后的吸光度；Aj：样品与溶剂混合液的吸光度。

1.3.2 5 -HMF的测定

参照 Zhang 等［19］和张玉玉等［20］的方法进行5-HMF的测定。5-HMF标曲配制：将5-HMF标准品用10%甲醇溶液配制成0.5、1.0、2.0、4.0 mg/L的不同质量浓度的标准溶液（现用现配）。检测条件：色谱柱Agilent TC-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm），Agilent TC-C18保护柱；流动相为乙腈和0.1%甲酸水溶液（V乙睛∶V0.1%甲酸=10∶90）；流速为1 mL/min；柱温为35℃；进样量为10μL；二极管阵列检测器波长为285 nm。5-HMF标准样品不同质量浓度的色谱图如图2所示。根据检测样品中5-HMF色谱峰面积及其相对应的质量浓度，从而可计算出样品中5-HMF的含量，以5-HMF的质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程y=16 212x+832.35，R2=0.999 8，表明5-HMF质量浓度与色谱峰面积线性关系良好。

图2 5-HMF标准HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of 5-HMF standards

1.3.3 褐变度的测定

将样品稀释20倍，用分光光度计在420 nm波长下测定其吸光值［21］。每个样品做3次平行试验，取平均值。

1.4 数据分析

采用 Excel 2010 和SPSS 18.0软件对数据进行差异性统计分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 反应温度对Suc-Asn反应体系的影响

反应温度对Suc-Asn反应体系中5-HMF生成量、DPPH自由基清除能力和褐变度的影响如表2所示。5-HMF生成量随反应温度的升高呈现先增加后趋于平稳的趋势。当反应温度高于140℃时，5-HMF生成量得到显著性提升，160℃时5-HMF含量仅为3.81 mg/L，当温度为200℃时5-HMF含量达到最大值73.63 mg/L，此时可达最大抑制率66.73%。DPPH自由基清除能力随反应温度升高而加强，最大可达92.73%，褐变度也达最大值，这可能是由于当反应温度较低时，蔗糖与天冬酰胺未能反应完全，此时5-HMF的形成是一个累加的过程，随着反应温度的继续升高，5-HMF的累加速度受到抑制，聚合或分解反应加剧［22］，所以5-HMF的含量会趋于平稳，体系抗氧化能力增强，类黑素与焦糖色素的生成量也随之增加，致使褐变度增加。

2.1.2 反应时间对Suc-Asn反应体系的影响

反应时间对Suc-Asn反应体系中5-HMF生成量、DPPH自由基清除能力和褐变度的影响如表3所示。5-HMF含量随着反应时间的延长呈显著性增长趋势，在12 min时抑制率可达75.39%。随着反应时间的延长，DPPH抗氧化能力呈现先缓慢增加至趋于平稳后降低的趋势，在12 min时达到最大值，这一结果与涂宗财等［23］研究的样品经高温长时间热处理导致抗氧化活性降低的结论一致。吸光值随反应时间的增加而增加，在16 min时吸光值达到最大值，反应前期，由于时间相对较短，美拉德产物产出量相对较少，随着反应时间的增加，产物量得到积累［24］，致使褐变度增加。

表2 反应温度对Suc-Asn反应体系的影响Tab.2 Effect of reaction temperature on Suc-Asn reaction system

表3 反应时间对Suc-Asn反应体系的影响Tab.3 Effect of reaction time on Suc-Asn reaction system

2.1.3 黄原胶质量浓度对Suc-Asn反应体系的影响

黄原胶质量浓度对Suc-Asn反应体系中5-HMF生成量、DPPH自由基清除能力和褐变度的影响如表4所示。反应产物5-HMF生成量、褐变度随着添加黄原胶质量浓度的升高而降低，而样品对DPPH自由基的清除能力呈现先增大后降低的趋势，在添加黄原胶质量分数为0.3%时达到最大值。5-HMF生成量的变化趋势说明，不同质量浓度的黄原胶溶液可显著抑制反应产物5-HMF的生成，其抑制机理可能是因为添加黄原胶质量浓度增大，溶液黏稠度随之增加，体系流动性降低，此时反应底物被包埋，不利于美拉德反应的进行，从而抑制5-HMF的生成。

表4 黄原胶质量浓度对Suc-Asn反应体系的影响Tab.4 Effect of xanthan concentration on Suc-Asn reaction system

2.1.4 pH值对Suc-Asn反应体系的影响

pH值对Suc-Asn反应体系中5-HMF生成量、DPPH自由基清除能力和褐变度的影响如表5所示。5-HMF生成量随pH值的增加呈现先降低后增加再降低的变化趋势，在pH值为3时达到最低值0.29 mg/L，此时抑制率为96.35%，当pH值为7时5-HMF含量仅为0.31 mg/L。DPPH自由基清除能力随着pH值的增加呈现先增加后降低再增加的变化趋势，在pH值为3和8时DPPH自由基清除能力分别为88.89%和86.87%。吸光值随pH值的增加呈先降低后增高再降低的显著性波动变化趋势。高pH值既有助于羰氨缩合使反应产物增加，又有助于糠醛类物质重排成还原酮类产物。故5-HMF含量和DPPH自由基清除能力相对较高［25］。

表5 pH值对Suc-Asn反应体系的影响Tab.5 Effect of pH value on Suc-Asn reaction system

2.2 Suc-Asn反应体系检测指标的相关性分析

对Suc-Asn反应体系在160℃下不同反应时间的样品5-HMF含量、褐变度以及抗氧化能力进行相关性分析，相关系数r可以反映两个变量间的相关密切程度。本试验中判断两变量相关密切程度的具体标准为：0＜∣r∣＜0.3表明微弱相关；0.3＜∣r∣＜0.5表明低度相关 ；0.5＜∣r∣＜0.8表明显著相关；0.8＜∣r∣＜1.0表明高度相关。

由表6可知，5-HMF含量与褐变度的相关系数最大，呈高度相关，其次是褐变度与抗氧化能力的相关系数，最后为5-HMF与抗氧化能力低度相关。褐变度能衡量美拉德反应的程度是由于美拉德反应中会产生大量棕色含氮的共聚物和聚合物，即类黑素［26］，美拉德反应还会产生影响热加工食品的风味色泽的中间产物和挥发性香气物质等［27-28］，这些物质还具有一定的抗氧化性［29］。

表6 测定指标的相关系数Tab.6 Correlation coefficient of determination standard

2.3 正交试验结果分析

为确定各因素的最佳参数，在单因素试验基础上，选定时间A、温度B、黄原胶质量浓度C、pH值D四个因素的合适范围进行正交试验，具体水平如表3所示，正交试验结果见表7。因本试验的最优组合要求黄原胶溶液能对Suc-Asn体系中5-HMF形成起到抑制作用，因此应选择最小K值作为每个因素的最优水平组合成最优组合（Ki表示任意列上水平号为i时所对应的试验结果之和，R是每个因素下K的最大值减最小值）。

由表8可以看出，时间、温度、浓度、pH值这四个因素的极差R值分别是24.01、50.68、19.19、27.70，所以这四个因素对Suc-Asn体系中5-HMF形成影响的主次顺序是B＞D＞A＞C，即温度＞pH值＞时间＞浓度。时间、温度和浓度中K1最小，pH值中K3最小，因此只考虑抑制体系中5-HMF含量这一指标时，最优组合为A1B1C1D3，即当反应时间为12 min，反应温度为160℃，添加0.1%黄原胶溶液及pH值为7时，黄原胶可对Suc-Asn体系中5-HMF的形成起到最佳的抑制作用。但是试验组并没有该组合，因此需要进行验证性试验。

表7 正交试验因素水平表Tab.7 Factors and their levels in the orthogonal array design

表8 正交试验结果Tab.8 Experimental design and corresponding results for orthogonal array analysis

2.4 验证性试验

通过检测5-HMF含量，将分析最佳组合与试验最佳组合得出的含量进行比较，试验重复三次，试验结果见表9。由表9可知，正交试验分析得出的最优组合产生的5-HMF含量低于试验最优组，因此分析结果成立，即试验的最优组合为反应时间12 min，反应温度160℃，0.1%黄原胶溶液，pH为7。

表9 验证性试验Tab.9 The replication experiment

3 讨论

本试验通过建立Suc-Asn反应体系模拟美拉德反应过程，探究反应时间、反应温度、黄原胶质量浓度、体系pH值这四个因素对体系中5-HMF生成量、抗氧化能力和褐变度的影响。在单因素试验中，不同反应时间、反应温度、黄原胶质量浓度和体系pH值均对5-HMF生成量有显著影响，抑制率从5.20%到80.00%不等。反应前期，反应时间较短，反应温度较低时，蔗糖与天冬酰胺反应不完全，此时美拉德产物产出量相对较少，随着反应的继续进行，产物量得到积累，致使5-HMF生成量增加，体系抗氧化能力增强，褐变度增加。体系pH值既能影响羰氨缩合反应的程度，又能在高pH值时促使糠醛类物质重排成还原酮类产物，引起褐变。黄原胶独特的胶凝作用可使得体系流动性降低，反应底物被包埋，从而抑制美拉德反应的进行。在单因素试验的基础上进行正交试验，得到最佳反应条件：反应时间为12 min，反应温度为160℃，0.1%的黄原胶溶液，pH值为7。此时反应产生的5-HMF含量最低。

目前关于黄原胶抑制热处理食品中5-HMF生成量的研究相对较少，多是研究黄原胶对美拉德反应丙烯酰胺生成量的影响或抗氧化剂对美拉德反应产物5-羟甲基糠醛生成量的影响。Shapla等［30］研究发现通过调节加工温度可显著减少5-HMF的形成。陈季旺课题组［10-12］研究发现在外裹糊中添加黄原胶可显著增加美拉德反应产物丙烯酰胺的生成量，但本试验研究发现黄原胶对5-HMF生成量有抑制作用，这可能是由于黄原胶可促进5-HMF进一步转化成丙烯酰胺［14］，但其具体机理还需进一步证实。张振华［31］发现当pH为5.7时，5-HMF产量最低。Aykin等［32］研究发现在面制品中添加适量NaHCO3可有效抑制5-HMF的生成。张易楠［33］发现槲皮素和表儿茶素的羟基氢可与5-HMF及其前体的羟基发生分子间脱水反应，从而抑制5-HMF含量的产生。目前关于抑制5-HMF生成的研究相对较多，且其抑制方法繁多，黄原胶虽可减少5-HMF含量的生成，且与其他抑制方法存在一定的相似性，但其抑制机理仍有待进一步研究，此试验旨在为5-HMF的控制提供更多依据。