姜黄素通过调控miR-21抑制乳腺癌细胞MCF-7增殖促进细胞凋亡机制研究*

王贵年 禹亚杰 王佳妮

四川护理职业学院，四川省成都市 610100

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率较高，并且发病率逐年升高，严重影响女性的工作和生活，目前化疗是乳腺癌患者术后辅助治疗的主要手段，但易产生骨髓抑制、神经损伤等严重不良反应。姜黄素是从姜科植物姜黄等的根茎中提取得到的天然多酚类化合物,具有降血脂、抗氧化、抗菌消炎、免疫调节等多种药理作用和生物学功能，可通过多种途径抑制肿瘤生长[1]。据相关文献报道，姜黄素可调控microRNA(miRNA)表达，从而发挥抗肿瘤作用[2-3]。本研究旨在明确miR-21在姜黄素抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖促进细胞凋亡机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 人乳腺癌细胞株MCF-7购自中国科学院分子细胞科学卓越创新中心；胎牛血清、RPMI-1640培养液购自美国Gibco公司；DMEM细胞培养基(含100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素)、二甲基亚砜(DMSO)、MTT试剂购自美国Thermo Scientific HyClone公司;姜黄素(Sigma公司),用DMSO溶解,配制1mmol/L的储备液；SYBR® Premix Ex TaqTM、miR-21引物均购于大连宝生物公司；Caspase-3活性检测试剂盒(比色法)购自北京雷根生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养:MCF-7在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养液37℃,5%CO2细胞培养箱进行培养，取对数期的细胞，加入0.25%胰蛋白酶进行消化并传代，用于实验。

1.2.2 qRT-PCR检测miR-21表达:经不同浓度(1、5、10、20、40μmol/L) 姜黄素24、48、72h作用MCF-7细胞，提取总RNA，使用SYBR® Premix Ex TaqTM试剂盒检测miR-21表达水平，以U6 snRNA作为内参对照，PCR扩增条件：95℃10min，95℃变性10s，60℃退火55s ，60℃延伸 60s，45个循环，用△Ct=CtmiR-21-CtU6 snRNA法计算miR-21表达水平。

1.2.3 MTT 比色法检测细胞增殖:取对数生长期MCF-7细胞，按照每孔5×103个细胞量加入细胞培养板中，设立实验组和对照组，试验孔中加入100μl不同浓度姜黄素(1、5、10、20、40μmol/L), 于37℃、5%CO2培养箱中培养24h， 37℃、5% CO2条件下培养24、48、72h；终止培养前6h，每孔加入5mg/ml MTT溶液(每孔10μl)后继续培养，终止时弃去培养板孔内上清液，加入100μl DMSO, 用微孔振荡器振荡1min，酶标仪测定各孔A490nm值，计算细胞增殖抑制率[4]。

1.2.4 Transwell检测细胞迁移:采用RPMI1640 培养液4∶1稀释包被Transwell小室底部膜的上室， 37℃放置1h。取对数生长期的MCF-7细胞，胰酶消化细胞，PBS清洗2次，调整细胞密度为4×105/100μl。每个小室加入100μl细胞悬液，并加入不同浓度(1、5、10、20、40μmol/L)姜黄素，下室分别加入20%胎牛血清的DMEM培养基，37℃、5%CO2培养箱中培养培养48h，吸取上室的细胞悬浮液，用4%的多聚甲醛固定15min，用1%结晶紫染色20min，在光学显微镜下取 3～5个视野进行计数[5]。

1.2.5 Caspase-3活性检测:取对数生长期MCF-7细胞，用不同浓度姜黄素(1、5、10、20、40μmol/L)处理48h后，用PBS洗涤细胞，0.25%胰蛋白酶消化、收集细胞，离心后弃去上清后制成细胞悬液，加入细胞裂解液，按照Caspase-3活性检测试剂盒(比色法)操作说明步骤，酶标仪测定A405nm值，同时并绘制标准曲线，检测各组MCF-7细胞的Caspase-3活性(pmol/min/μg)。

2 结果

2.1 姜黄素抑制miR-21表达 使用不同浓度姜黄素(1、5、10、20、40μmol/L)作用MCF-7细胞为实验组，随着姜黄素浓度升高，miR-21表达量逐渐降低，在10μmol/L、 20μmol/L和40μmol/L组，与1μmol/L、5μmol/L组比较，miR-21表达量明显下降(P<0.01)， 见图1。

图1 不同浓度姜黄素对MCF-7细胞miR-21表达的影响

2.2 姜黄素抑制MCF-7细胞增殖 不同浓度的姜黄素(1、5、10、20、40μmol/L)作用于MCF-7细胞，与DMSO为对照组比较，实验结果显示，在24h、48h、72h后， 20μmol/L和40μmol/L组细胞增殖抑制率明显升高，随着姜黄素浓度的增加，作用时间越长，抑制作用越明显，呈现出剂量及时间依赖性(P<0.01)，见图2。

图2 不同浓度姜黄素对MCF-7细胞增殖程度的影响

2.3 姜黄素抑制MCF-7细胞迁移 Transwell检测细胞迁移能力，实验结果显示，不同浓度的姜黄素(1、5、10、20、40μmol/L)能够降低MCF-7细胞的迁移能力，其48h的抑制率随着姜黄素浓度增加，其抑制作用越强，并且呈现出剂量依赖性(P<0.01)，见图3。

图3 姜黄素对MCF-7细胞迁移的影响

2.4 姜黄素能够促进MCF-7细胞凋亡 经过不同浓度姜黄素(1、5、10、20、40μmol/L)处理48h后的MCF-7细胞进行Caspase-3活性检测。实验结果显示，与对照组相比，随着姜黄素浓度的不断增加，Caspase-3活性表达程度呈现出上升趋势，表明姜黄素能够促进MCF-7细胞凋亡(P<0.01)，见图4。

图4 姜黄素对MCF-7细胞凋亡的影响

3 讨论

乳腺癌位居女性恶性肿瘤发病之首，发病率逐年增高趋势[6]。乳腺癌主要使用手术、化学治疗、内分泌等治疗方式，但其复发性、转移性等受多种因素的影响[7]。姜黄素是一种脂溶性多酚类化合物，主要存在于姜黄、郁金、莪术等的根茎中，具有抗感染、抗氧化、抗炎、抗肿瘤等作用，对肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌等产生抑制肿瘤细胞生长和诱导肿瘤细胞凋亡的作用[8]。

乳腺癌的发生与miRNA的异常表达有关，miRNAs在乳腺癌组织中异常表达并且参与调控细胞的凋亡和侵袭等过程[9]。miR-21是单个基因编码miRNA, 编码基因位于17q23.2。miR-21在多个实体瘤(乳腺癌、直肠癌、肺癌等)中的表达均上调，参与肿瘤细胞的增殖与转移等有关[10-11]。近年来相关文献报道，乳腺癌患者血清miR-21高表达，不仅与乳腺癌的发生有关，而且其表达上调可能会导致淋巴结转移，miR-21可作为一个肿瘤转移促进基因，在乳腺癌的转移中发挥作用[12]。

细胞凋亡是基因控制的细胞自然死亡，Caspase与细胞凋亡有关的蛋白家族，其中Caspase-3位于细胞凋亡反应的下游；Caspase-3在正常情况下无活性，被激活后能够发挥促进凋亡的作用[13]。据相关研究报道，Caspase-3是细胞凋亡的关键酶，与肿瘤的发生、侵袭、转移等密切相关，姜黄素能促进肿瘤细胞中Caspase-3等相关凋亡因子活化，抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡[14]。

本实验结果显示，经姜黄素作用MCF-7细胞后，qRT-PCR检测miR-21呈低表达水平；不同浓度的姜黄素均能抑制MCF-7细胞增殖并促进其凋亡；随着姜黄素浓度递增, MCF-7细胞miR-21的表达减少，Caspase-3活性表达增加，Caspase-3的表达增加呈剂量依赖性；提示姜黄素可能通过调控miR-21的表达并通过促进乳腺癌细胞凋亡，从而对乳腺癌的抑制作用。

综上所述，姜黄素通过下调miR-21的表达，抑制乳腺癌细胞MCF-7细胞增殖，并促进其凋亡。本研究结果能够为临床应用姜黄素治疗乳腺癌提供实验理论依据。