好氧丰盛/缺氧饥饿模式驯化微生物积累内源聚合物并实现内源反硝化

崔有为， 王好韩， 金常林

(1.北京工业大学城镇污水深度处理与资源化利用国家工程实验室， 北京 100124；2.北京首钢国际工程技术有限公司， 北京 100043)

聚羟基脂肪酸酯(PHA)是微生物在细胞内积累的一类胞内多聚物，是微生物在不平衡生长条件下对外源碳源的积累，是还原力和能源的储存. PHA可以应用于工业生产、生活和医学等领域. 目前，PHA作为生物可降解塑料替代传统塑料引起了广泛的学术研究[1]. PHA积累菌是在非平衡生长条件下能够储存碳源的一类微生物. 已经发现的具有PHA积累能力的微生物达到300多种[2]. 富集PHA合成混合菌普遍采用丰盛(feast)/饥饿(famine)(F/F)运行模式[3-4]，即在好氧条件下碳源充足(丰盛)和碳源缺乏(饥饿)阶段交替运行，而且给予较长时间的饥饿期(即低F/F). 活性污泥在非稳态条件下，能够积累PHA的菌群逐渐占据优势，并激发微生物内源储存能力. F/F选择压机制是一种高效的积累PHA的驯化方式. 好氧F/F(O- F/F)选择模式驯化城市污水处理厂活性污泥是被普遍采用的富集PHA积累微生物的方法[5-6]. 但是，O- F/F模式驯化需要全程曝气，耗能大，且驯化的菌群功能较为单一. 有研究表明，PHA积累菌除了可以利用分子态氧(O2)氧化PHA产生能量外，还能够在缺氧条件下利用化合态氧(NOx-N)氧化PHA产生能量[6-8]，这为实现好氧PHA积累和缺氧PHA的利用(O/A- F/F模式)提供理论基础. O/A- F/F选择模式仅在较短的底物丰盛期进行曝气，相较于O- F/F模式可以节约在饥饿期的能耗. 同时也为好氧阶段的生物多聚物的原位利用提供可能. 但是， 由于O/A- F/F模式研究才刚刚起步，尤其是利用实际污水实现O/A- F/F模式及其对该模式的特性研究少有报道.

我国城市污水中碳氮比较低，有机物在曝气池被氧化成为二氧化碳，剩余的有机物不足以用来完成后续的反硝化[7-9]，在缺氧段需要投加碳源以完成反硝化，这大大增加了污水处理厂的运营成本. 而O/A- F/F选择模式可以在好氧段将有机物以PHA的形式储存到胞内，在缺氧段以PHA作为反硝化碳源. 这为污水处理碳源不足的问题提供了有效的解决办法.

基于上述研究背景，本文采用O- F/F与O/A- F/F两种选择模式同时驯化活性污泥，从生物功能和生物组成等层面比较2种模式的差别，并对O/A- F/F模式缺氧段PHA内源反硝化的特性进行分析，为O/A- F/F在污水处理中的工程应用奠定基础.

1 材料与方法

1.1 废水和接种污泥

废水采用北京工业大学家属楼的生活污水，生活污水经过化粪池处理，水质指标如表1所示. 由于生活污水挥发性有机酸含量不足影响PHA积累菌群的富集，本研究在进水中投加乙酸钠，控制进水COD在300 mg/L左右. 实验污泥取自北京某污水处理厂，该活性污泥有机物去除、脱氮除磷和污泥沉降性能良好. 污泥接种后，反应器内污泥质量浓度为3 000 mg/L、污泥容积指数(SVI)为54 mL/g.

表1 生活污水水质条件Table 1 Quality of the sewage wastewater

1.2 反应器的运行

实验采用2个相同的序批式生物反应器(SBR)，有效容积8 L，分别采用O- F/F和O/A- F/F两种运行模式运行且均维持F/F=0.1，O/A- F/F选择模式的缺氧饥饿期投加硝酸盐(20 mg/L)提供氧化态氮源. SBR周期运行包括进水5 min，好氧丰盛的时间以监控溶解氧(DO)跃升高于3 mg/L来控制. 沉淀1 h，排水5 min，闲置1 h. 每天运行2个周期，排水比为0.5，污泥龄(SRT)控制在20 d，温度控制在28±2 ℃，曝气量用气体流量计控制在60 L/h. 活性污泥经过O- F/F和O/A- F/F两种运行模式连续3个SRT的选择富集.

1.3 计算

污泥中PHA的质量分数:

(1)

式中：w(PHA)为污泥中PHA的质量分数；m(PHA)为PHA的质量，mg；m(VSS)为污泥的质量，mg.

污泥中糖原的质量分数:

(2)

式中：w(糖原)为污泥中糖原的质量分数；m(糖原)为糖原的质量.

内源聚合物产率：

(3)

式中：Y为PHA(Yp/s)或糖原(Ygly/s)的产率；Δpolymer为PHA或糖原产量，mg/L；ΔS为外源基质降解量，mg/L.

好氧丰盛段的比内源生产速率qp和饥饿段的比内源消耗速率rp：

(4)

式中：qp为比内源生产率，mg/(h·g)；rp为比内源降解速率，mg/(h·g)；ρ(VSS)为污泥质量浓度，mg/L；ΔT为饥饿段内源降解时间，h；Δpolymer为内源PHA或糖原产量，mg/L.

比基质的摄取速率：

(5)

式中：qs为比基质的摄取速率，mg/(h·g)；ΔCOD为外源基质降解量，mg/L；ΔT为缺氧反硝化时间，h.

VSS、PHA、糖原的分子式分别是CH1.8O0.5N0.2[10]、CH1.5O0.5[11]和CH2O(糖原检测实际以葡萄糖为标准曲线). VSS、PHA和糖原摩尔质量分别是24.6、21.5和30.0 mg/mmol.

1.4 分析方法

1.5 微生物菌群分析

连续运行60 d以后采集O- F/F和O/A- F/F两种运行模式下的驯化稳定后的活性污泥，使用E.Z.N.A.®固体DNA试剂盒(Omega Bi- TEK，Norcross，GA，美国)从样品中提取微生物DNA. 采用扩增细菌16S核糖体RNA基因的V4～V5区且带条形码的引物经PCR扩增. 每个样品设3个平行样，将对应的3个PCR扩增产物混匀为1个样本；将回收阳性克隆条带用Tris HCl进行洗脱，根据2.0%琼脂糖电泳对各阳性胶回收产物的初步定量结果，采用蓝色荧光定量系统(QuantiFluorTM-ST， Promega，美国)定量检测待测样PCR产物后，将各待测样的PCR产物根据测序量要求进行混合. 根据标准方案，在Illumina MiSeq平台上将纯化扩增子整合[15-16]. 原始序列保存到NCBI数据库，存档序列为SRP2905300.

2 实验结果与讨论

2.1 O- F/F和O/A- F/F模式系统周期动态变化

2.2 O- F/F和O/A- F/F模式下PHA积累比较

O- F/F和O/A- F/F两种模式下内源聚合物PHA积累见表2. O- F/F模式下PHAmax高于O/A- F/F模式，分别为7.01%和5.50%. 此外，O- F/F模式下的Yp/s也高于O/A- F/F模式，分别为0.75和0.52. O- F/F模式下，根据文献报道，Yp/s在0.20～0.65，Yp/s主要受到底物类型的影响，在本研究中由于在生活污水投加了乙酸，提高了底物转化PHA的比率.

表2 O- F/F与O/A- F/F模式下活性污泥积累PHA的比较Table 2 Biopolymer PHA production by activited sludge using O- F/F and O/A- F/F operation modes

①为未报告;②为PHA浓度，mmol/L;③为挥发性脂肪酸(VFAs)，包括乙酸、丙酸和丁酸;④为周期时长分别为24和6 h的PHA产率，分别为0.34和0.20.

2.3 O- F/F和O/A- F/F模式下糖原积累比较

对比分析O- F/F和O/A- F/F两种运行模式条件下内源聚合物糖原的积累表明(见表3)，O- F/F和O/A- F/F运行模式下微生物的糖原质量分数分别为4%和5%，相差不大. 而在普通活性污泥中，糖原的质量分数为10%左右[30]. 2种模式下并没有实现糖原的有效积累，反而导致糖原的质量分数降低. 表明2种模式下底物可以被充分利用合成PHA.

①为糖原浓度，mmol/L;②为周期时长分别为24和6 h的糖原产率，分别为0.17和0.55.

2.4 O/A- F/F模式以PHA为内碳源驱动反硝化

如图1(b)所示，O/A- F/F模式运行下丰盛期结束时投加的20 mg/L的NOx-N，在缺氧饥饿期可以达到95%的去除率. 在这期间外源COD几乎不变，而PHA含量逐渐降低，证明在缺氧段系统以PHA为内碳源进行反硝化. 经过3个SRT的驯化，系统的PHA产率、比PHA产率和比反硝化速率(SDNR)趋于稳定(见图2). Chen等[32]以不同碳源为基质研究对内源反硝化的影响，结果表明以乙酸钠为碳源时SDNR为8.5 mg/(h·g)，以丙酸钠和葡萄糖为碳源SDNR均为7.0 mg/(h·g)左右，以甲醇和乙醇为碳源的SDNR为6.0 mg/(h·g). 本实验的SDNR为2.76 mg/(h·g)可能是因为投加NOx-N量较少所导致的. 另一方面，不同碳源的SDNR也不同，而本实验碳源主要为生活污水加乙酸，碳源成分较为复杂，所以SDNR较低.

2.5 O- F/F和O/A- F/F模式富集的微生物菌群组成

对驯化泥样进行16S rRNA MiSeq 焦磷酸测序分析种群结构. 基于丰度>1%的种属分析，在门水平Proteobacteria和Bacteroidetes在O- F/F和O/A- F/F运行模式下均为优势菌群(见图4). 在2种选择模式下Proteobacteria菌门丰度分别为56.02%和49.11%，Bacteroidetes菌门丰度接近，分别为34.91%和31.51%. 此外，2种模式的系统中都含有一定丰度的Firmicutes菌门微生物. 研究报道Firmicutes、Baterioidetes 和 Proteobacteria 菌门的微生物均具有积累PHA的能力，在驯化后的积累PHA菌群中为优势菌群[6,34]，与本研究结论相同. 这些优势菌群和系统功能的发挥具有正相关性. 但是，Chlorobi、Spirochaetes、Lentisphaerae和GN02在O/A- F/F运行模式系统中丰度分别是 8.69%、1.44%、2.72%和2.85%，远高于O- F/F模式系统中该菌群丰度(<1%). 相反，Planctomycetes和Verrucomicrobia在O- F/F模式系统中菌群丰度分别为2.12%和1.41%，但在O/A- F/F模式系统中菌群丰度均很少(<1%). 表明不同模式的优势菌群不同，从而导致系统功能的差异性.

在纲水平(见图5)，O- F/F和O/A- F/F两种选择模式下中Betaproteobacteria纲均为各系统中的优势菌纲，丰度分别为29.54%和40.56%. Alphaproteobacteria、Gammaproteobacteria菌纲在O- F/F运行模式下菌群丰度高于O/A- F/F运行模式，丰度分别为8.13%和1.72%、6.48%和2.89%. Deltaproteobacteria纲丰度在2个系统中相似，分别为1.11%和1.02%. Betaproteobacteria纲具有PHA积累能力[6]. Venkateswar等[38]在O- F/F模式下积累PHA的研究中发现Gammaproteobacteria(39%)是优势菌群. Ince和Ciggin等[34,39]发现Gammaproteobacteria和Alphaproteobacteria是优势菌群并负责PHA积累. 本研究O- F/F驯化模式结果和上述研究的结论相似，Gammaproteobacteria和Alphaproteobacteria为优势菌纲，高于O/A- F/F模式，这可能是O- F/F模式具有较高PHA积累能力的原因. O/A- F/F选择下的优势微生物Betaproteobacteria纲中有大量的反硝化菌[35]，而且Betaproteobacteria纲中的Acidovorax、Comamonas和Simiplicispira菌属具有以PHA为内碳源进行反硝化的功能[35,37]，这可能是O/A- F/F驯化模式得到的菌群具有内源反硝化的原因.

此外，Bacteroidetes门下的Flavbacteriia和Sphingobacteriia纲的丰度在O- F/F模式富集丰度高于O/A- F/F模式，分别为14.83%和2.63%， 5.15%和<1%，Huang等[40]的研究表明Flavbacteriia纲微生物具有PHA积累能力，这与O- F/F模式具有较高的PHA积累能力相一致. Bacteroidetes门下的Unclassified Bacteroidetes，Lgnavibacteria和Bacteroidia这些在O- F/F模式丰度<1%的菌纲在O/A- F/F选择模式下的丰度为13.21%、 8.52%和5.13%，这些菌纲均具有PHA积累的功能[41-42]. 虽然2种驯化模式的优势菌群都有PHA积累能力，但是优势菌群不同，导致2种模式的PHA积累能力有所差异.

3 结论

1) 本研究证明O/A- F/F选择模式是有效的. 在这种选择模式下可以驯化活性污泥实现好氧PHA积累和缺氧内源反硝化的功能. 这种生物功能的实现为实现好氧有机物储存和PHA在污水处理的原位利用奠定基础.

2) O- F/F选择模式的PHA产率和最大细胞干重大于O/A- F/F模式，糖原在2种模式下没有明显积累.

3) O- F/F选择模式下Alphaproteobacteria，Gammaproteobacteria纲是优势的PHA积累菌. O/A- F/F选择模式下Betaproteobacteria纲微生物是优势菌群. Bacteroidetes门下的Unclassified Bacteroidetes、Lgnavibacteria和Bacteroidia纲也是O/A- F/F选择模式下富集的优势功能微生物.