成年人血DDT含量与DNA氧化损伤及糖脂代谢的关联研究

刘亚航，徐晓凡，赵慧

【摘要】目的：探究成年人血滴滴涕（DDT）水平与DNA氧化损伤及糖脂代谢的关联，以及DDT是否通过氧化损伤DNA影响糖脂代谢。方法：本研究以武汉社区队列汉口、汉阳2个社区的居民603名。通过问卷调查收集个人基本信息和生活习惯及职业史等信息，通过体检检测血糖血脂平，并收集空腹外周血和随机尿样。本研究采用GC-MS/MS测定研究对象的血清中DDT水平，以此评估人群DDT的内暴露量;采用高效液相色谱法测定DNA氧化损伤标志物：尿8-OHdG水平，采用线性回归模型分析DDT与尿8-OHdG、血糖水平、血脂水平、糖尿病以及高脂血症的关联;采用中介分析法分析8-OHdG在DDT与糖脂代谢关联中的中介效应，为机制探索提供一定依据。结果：血中pp’-DDT水平与血糖和血脂有明显关联，暂不能排除8-OHdG的中介作用。

【关键词】DDT;8-OHdG;血糖;血脂;中介效应分析

【中图分类号】R363 【文献标识码】A 【DOI】10.12332/j.issn.2095-6525.2020.13.253

DDT是一种持久性有机污染物（persistentorganicpollutants，POPs），具有高毒性、持久性、积累性和迁移性。近年来我们我国居民体内DDT水平是否发生变化尚未可知。本研究通过检测一般城市居民血中DDT含量来评估DDT的残留情况。既往研究多关注DDT的致癌性和生殖毒性，而較少有研究关注DDT对代谢性疾病的影响。糖尿病和高脂血症是环境相关性代谢性疾病。多项研究表明，发生与多种因素相关，另外，DDT暴露可诱导机体的氧化应激和系统炎症，而氧化损伤是糖尿病和高脂血症等代谢性疾病的重要致病机制。

基此，本研究以中国城市成年居民为研究对象，探讨DDT对血脂代谢的影响以及其部分机制，为综合防控糖尿病和高脂血症提供一定的科学依据。8-羟基脱氧鸟苷（8-hydroxy-2’-deoxyguanosine，8-OHdG）是由ROS介导的氧化性损伤的主要代表形式，故选取尿8-OHdG作为评价机体氧化性DNA损伤的标志。肌酐是人体内生代谢产物，其生成和排泄均较恒定，此为了排除因尿液稀释和个体差异等因素的影响，用尿肌酐来校正尿8-OHdG。

1 资料与方法

1.1资料来源

研究对象来自武汉社区队列。本部分数据来自长期居住在武汉市汉阳江汉小区和湖滨小区的成年居民共603人。排除因血样不足以检测DDT数据的样本（n=168）后，有435人有齐全的血DDT检测数据。排除因尿样不足以检测8-OHdG和尿肌酐数据的样本（n=30），并在此基础上，排除自报有患有糖尿病、高血脂、肿瘤、中风、心梗、慢阻肺、肺气肿、关节炎、胸膜炎、肝炎或肾炎的部分，其余（n=351）纳入本部分研究。

所有研究对象均签署知情同意书。本研究获得华中科技大学同济医学院伦理委员会批准。

1.2试剂

标准农药混合试剂（PesticideMix17）、正己烷、二氯甲烷（DCM）、8-OHdG标准品购于美国Sigma公司;分析纯尿素购于上海国药控股化学试剂有限公司;HPLC级甲醇为德国Merck公司产品;磷酸二氢钾、乙酸、柠檬酸和乙二胺四乙酸（EDTA）为北京国药集团化学试剂有限公司产品;氢氧化钠试剂来自天津光复精细化工研究所;乙酸钠来自天津科密欧试剂有限公司;肌酐（CREA）测定试剂购于深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司;双蒸水（监控室的纯水）来自武汉市泓源企业;高纯度氦气（N99.999%）;去离子水。所有试剂使用前均用0.22µm微孔滤膜过滤。

1.3方法

1.3.1 血DDT水平测定

取出冰冻分装的血浆（0.5ml）融化至室温，离心混匀。加入13C6标记的HCB，再加入0.5mL去离子水，进行涡流。用500mg尿素对血浆蛋白进行变性处理，涡旋超声处理25min。分离有机相至另一试管中，在40℃水浴下氮吹浓缩至0.5ml。将HLB固相萃取小柱装在VacElutSPE24上，依次用3mLDCM、5mL甲醇和5mL去离子水进行淋洗。在最大真空度下抽真空干燥10min。

采用无分流方式将1μL提取液注入到配备了AgilentDB-5ms（30m×0.25mm×0.25μm）毛细管柱的Agilent6890N-5975气相色谱质谱联用仪中，注射入口温度设定为250℃。以高纯度氦气（N99.999%）为载气，控制恒定流速为1.0mL/min。烘箱温度程序设置为：初始温度60℃保持1min，后每分钟升高30℃至180℃保持1min，然后每分钟升高7℃至280℃保持2min。使用MassHuntersoftware软件进行仪器控制、数据采集与分析。

1.3.2 尿8-OhdG水平测定

取出冰冻分装的2ml尿样于38℃水浴融化，离心10min（4℃，5000rpm）。固相萃取（SPE）小柱的预处理：将BondElutLRCC18-OH固相萃取柱调为低真空密度。依次加入约10ml纯甲醇、约5ml去离子水，约10ml0.1mol/LKH2PO4（pH6.0）冲洗。再用3ml去离子水淋洗，在最大真空度下抽真空干燥10min。尿液吸附、洗脱、收集，取1.5ml预处理尿样过C18-OH固相萃取柱小柱。依次用3ml0.1mol/LKH2PO4（pH=6.0）、3ml5%甲醇淋洗，抽干5min。最后用1ml纯甲醇洗脱SPE小柱吸附的尿样，并收集洗脱液于1.5mlEp管，置于快速真空浓缩仪吹干甲醇（45℃，约3h，根据实际情况确定），4℃冰箱保存，进样前用0.1mol/L的KH2PO4（pH=6.0）1ml定容。临分析前，将样品用针头式滤器过滤至自动进样小瓶;再从中取100：l与900：l过滤的0.1mol/LKH2PO4（pH=6.0）混匀，40℃保存。取20μl进样检测。并制备8-OhdG标准曲线。

1.3.3 尿肌酐测定

将冰冻分装的尿样于37℃水浴融化，混匀，再取10：l融化尿样和490：l蒸馏水（比例可随意，如1：19）置于1.5ml离心管中，用恒温震荡混匀器（1400R/37℃）混匀，剪去离心管盖子，准备进样检测。

1.3.4 血生化水平测定

用全自动生化分析仪测定血糖浓度、TCHO和TG水平。

1.4统计学处理

样本中血op’-DDT和pp’-DDT的浓度高于检出限（99%），可纳入研究。采用one-sampleKolmogorov-Smirnov检验研究变量的正态性分布;将血pp’-DDT 经box-cox转换后、尿8OH-dG经自然对数转换后（pp’-DDT^（-0.8739））纳入研究，用Wilcoxon检验用于比较血DDT和尿8OH-dG在男女两性中的差异;用logistics 回归分析方法计算OR值和95%置信区间（95%CI），分析血 pp’-DDT水平与尿8-OHdG水平的相关性。用线性回归分析方法分析血pp’-DDT 水平与尿8-OHdG水平的相关性;

2 结果

2.1 血DDT和尿 8-OHdG在不同性别中的差异分析

使用Wilcoxon检验在不同性别中，血中DDT和尿8-OHdG的分布差异无统计学意义（表1）。

2.2 城市居民血 DDT 与尿 8-OHdG的关联性

根据尿8-OHdG水平的四分位数将研究人群分为 P25、P50、P75、P100四个组，以尿 8-OHdG最低浓度 P25 为对照组，用多元 logistics 回归分析血 pp’-DDT 水平与尿 8-OHdG 水平的相关性，结果见表2。并用线性回归模型进行分析，结果见表3。

2.3 血DDT、尿8-OHdG与糖脂代谢的关联性

TG经k-s检验符合正态分布（D=0.066，P 值=0.07912）;血 TCHO经k-s检验符合正态分布（D=0.065，P 值=0.08227）;血糖经过 box-cox 转换（GLU^（-2.4））后符合正态分布（D=0.068，P 值=0.06275）;用中介效应模型来分析血pp’-DDT、尿8-OHdG与糖脂代谢之间的相关性（表4）。

四分法logistics回归分析血pp’-DDT水平与尿8-OHdG水平的相关性结果第六列是瓦尔德检验显著性值（P值），此值大于0.05说明对应自变量（血pp’-DDT）的系数没有统计学意义，没有依据证明自变量（血pp’-DDT）对因变量（尿8-OHdG）不同分类水平的变化有显著影响。

线性回归分析血pp’-DDT水平与尿8-OHdG水平的相关性回归系数检验表第六列的显著性系数（P值）均大于0.05，故没有统计学意义。

线性回归分析血pp’-DDT水平与尿8-OHdG水平的相关性系数表第六列的显著性系数（P值）均大于0.05，故没有统计学意义。

3 讨论

本研究是以武汉市社区成年人为研究对象，通过问卷调查、健康体检和实验室指标，检测其血DDT检出水平可反映普通市民暴露背景DDT的水平。血中DDT的含量集中在一个很小的范围内，整体值偏小。这与我国 1983年后禁用 DDT有很大的关系，但由于DDT 在土壤中的半衰期从几年到十几年不等，故仍可在土壤和农产品中检测到 DDT 的残留[1]。本次用到的数据是基线数据，有理由相信后续随访中血 DDT 的含量会更低。本次数据的研究对象都居住在武汉的同一个小区，居民饮食的来源地比较局限，这也是DDT 含量集中在一个很小范围的原因之一。而尿中 8-OHdG 的分布呈右正偏态，这与机体的氧化反应与抗氧化反应水平的相关，符合先前报道中的分布情况[2]。本研究表明，在不同性别中，血中 DDT 和尿8-OHdG 的分布差异无统计学意义。当然，影响尿中 8-OHdG 的因素有很多，诸如饮食习惯、吸烟、饮酒、年龄等，在后续的研究中可以将多种影响因素引入，分类变量以百分比表示，以 Chi-square 检验比较各组间的差异;连续型变量以平均值（标准偏差）表示，用t检验比较各组之间的差异。分析比较了不同性别血中DDT残留量的差异，结果无统计学意义。发现血中pp’-DDT与糖脂代谢水平有显著性关联。由于建模的失败，导致中介效应分析的探究失败。已有文章阐释了8-OHdG与糖尿病的关联[3]，暂不能排除氧化性损伤在DDT对糖脂代谢影响中的中介作用。后续研究中可以在自变量（DDT）与中介变量（8-OHdG）建模成功后再分析氧化性损伤在其中发挥的作用。DDT对多种器官和系统有明显的毒性作用，有报道显示，DDT可引起明显的肝脏损伤[4]，而肝脏是进行氧化与抗氧化反应和物质代谢的重要场所，与糖脂代谢关系密切。故值得进一步探讨氧化损伤在其中发挥的作用。

下一步的研究思路：加入混杂因素进行分析，如：年龄、性别、饮食习惯、饮酒、锻炼等，分析这些混杂因素在男女性别中的分布差异，并进行卡方检验;探究血DDT和尿8-OHdG是否符合二元logistic回归，并将混杂因素加入回归模型进行校正;探究氧化损伤在血pp’-DDT与尿8-OHdG的关联关系中的作用。

参考文献：

[1]金士威，黎明，廖涛，惠阳，徐盈.武汉市郊农田土壤中有机氯农药的残留分析[J].武汉工程大学学报，2009，31（07）：1-3+22.

[2]肖丽丽.社区人群镉暴露与2型糖尿病的关联性研究及其相关机制探讨[D].华中科技大学，2019.

[3]高瑞霄，姚朱华，冯凭，唐亮.糖尿病患者尿8-OHdG水平变化及其与糖脂代谢指标的相关性[J].山東医药，2014，54（30）：76-77.

[4]赵苒，郭向宇，王娟，苏艳华，郑芳，范春.苯并（a）芘和滴滴涕联合暴露对小鼠肝脏细胞凋亡的影响[J].癌变·畸变·突变，2011，23（03）：194-198.

作者简介：

刘亚航（1998.9—），女，黑龙江省齐齐哈尔市人，湖北省武汉市华中科技大学同济医学院，预防医学专业，本科生。

徐晓凡（1999.11—），安徽省合肥市人，湖北省武汉市华中科技大学同济医学院，预防医学专业，本科生。

赵慧（1999.12—），河北省邯郸人，湖北省武汉市华中科技大学同济医学院。预防医学专业。本科生。