微生物菌种保存方法及技术要点

摘要：微生物保存是依据菌种变异快的特点，通过一定方法降低微生物的代谢活性，从而延长其保存期限。本文对微生物菌种保存方法进行概述，并分别阐述药品微生物菌种的主要保存方法和工业微生物菌种主要保存方法。只要选择恰当的保存方法，才达到良好的保存效果，真正实现保存的目的。

关键词：微生物菌种;保存方法;技术要点

现阶段，微生物产业已具相当大的规模，其中在发达国家占有生产总值比重较高。在微生物产值的不断增长的前提下，其中在工业、医药、农业等多个领域发挥着重要作用。本文主要对工业微生物菌株和药品微生物菌株的保存方法进行分析研究，可以得出其保存方法是否合理对保持菌株的优良特性十分重要。

1、微生物菌种保存方法概述

微生物菌种是一个基本的分类单元，其表型特征极其相似，并且与同属其他菌种有差异很大[1]。环境条件对微生物菌种的繁殖过程有一定的影响，其保存的主要目的是保持菌种的原有活力和形状，更好的完成微生物检验等工作。基于此，要做好优良的菌种的选择工作，将其代谢水平降低到最低，保证菌种不发生变异并保持相应的活性。菌种保存方法还要考虑到保存方法的经济性与便捷性，主要是操作成本以及生产推广使用的可行性。

2、药品微生物菌保存方法阐述

2.1  斜面低温保藏法

此方法是一种经常使用的保藏法，主要是将微生物菌种转移培养到斜面培养基中，待到微生物菌种全部覆盖于整个斜面之后，将其低温保藏，温度一般为4℃。通过一段时间之后，对微生物菌种按照相同的方法进行转培，通过保藏方法以及不断转培进行菌种的保藏。该方法具有的优势主要体现在操作简单、对操作设备要求低，并且菌种的存活率比较高。此方法适用于多种微生物菌种的短期保藏，其保存菌种的时间为几个月，并不适合需要长期保藏的菌种。在温度为4℃的情况下，菌种一般还具有一定的代谢水平，会使菌种的活性降低。同时，反复多次的培养菌种，容易使菌种发生变异，引发感染现象等。

2.2  石蜡油封藏法

此方法主要适用于培养成熟微生物菌种斜面，采用做过无菌处理并去除水分的石蜡，将培养斜面进行封存[2]。保证石蜡层的厚度比培养斜面顶端高大约1厘米，确保所培养的微生物菌种无法接触到空气。在封存完毕之后，使用固体石蜡将其封口，并垂直放于冰箱中，并保证冰箱的温度为4℃。此方法即考虑到低温，又考虑到与氧气隔绝，有效降低培养菌种的活性，使其延长保存菌种的时间，适合于保存1-2年的菌种。

2.3  定期移植法

此方法是通过不断传代培养进行保藏，主要保存方法有斜面培养、液体培养等，根据需要培养微生物菌种生存特性而选择不同的培养方法，此方法十分普遍。将微生物菌种接种于适宜的环境中进行培养，避免由于环境改变诱发菌种遗传物质的改变，使其改形状，等到成长充分之后选择4-6℃的环境中进行间隔保存，再进行传代培养，其保藏时间要根据微生物菌的不同而不同。此保藏方法具有操作简单、易于提取的优势，但需要经常移种培养，并且在培养的过程中微生物菌种无法完全与外部环境隔绝，而如果要长期保藏，该方法需要人力成本比较高，所以如果仅用于实验需要，短期内的保藏可以使用定期移植法。

3、工业微生物菌种保存方法

3.1  斜面低温保存法

斜面低温保存法经常用于工业微生物菌种实验室保存，主要适合不需要长期保存的菌株。为控制和防止菌种出现污染的现象，应该连续保存三代培养斜面。其优点主要体现在操作简单，菌株使用十分便捷，对设备无特殊要求。此方法的缺点是存储时间短菌种容易发生变异，在存储的过程中容易被感染。此方法的保存质量受到温度的影响。若培养时间比较短，在保存的过程中容易死亡;若培养的时间比较长，生产效率高。

3.2  干燥保存法

微生物的芽孢在干燥的环境中具有很强的抵抗力，干燥的环境可使微生物菌种的代谢活性降低到休眠的状态。干燥保存法主要是将菌种接种到合适的材料中，人为创造适宜的干燥环境，进行菌株的保存，其干燥环境可以借助于沙子、滤纸等。比如滤纸保存法，是将细胞或者是孢子吸附在无菌的滤纸上，进行干燥处理之后在低温保存，温度可设置为4℃，细菌可保存2年左右，对于一些丝状真菌甚至可以高达14-7年的保存期限。该方法具有保存时间长以及维护简单等优势。

3.3  超低温保存方法

该方法主要是将微生物菌种保存在零下150-零下195℃的超低温环境中，通常使用的甘油为菌株保护剂[3]。一般微生物的代谢在-130℃以下状态，会出现完全停滞状态，因此超低温保存法被认为最有效的防止细菌降解的方法。在制冷技术不断发展的基础上，超低温保存法已有几十年的使用历史，主要应用于工业领域菌种。此方法对各种微生物菌种都可使用，主要通过使用保护剂的细菌悬液密封于无菌冷冻管中，再进行缓慢冷冻。最佳冷却的速度为1℃/min。当温度降到零下35℃时，微生物悬液会迅速被放到液氮罐中。当在进行细菌的培养时，需要将其迅速融化，然后在合适的温度下在液体培养基中进行培养。

4、结束语

微生物资源是我国主要的战略生物资源，对微生物菌种的合理保存是十分重要的，对于微生物菌种保存方法既要考虑到经济性与便捷性，还要考虑到操作成本以及生產推广使用的可行性。对于药品微生物的保存方法，其中斜面低温保藏法是最为常见的保藏法，另外石蜡油封藏法、定期移植法等也经常应用于药品微生物的保存。而工业微生物菌种保存方法主要有边坡低温保存法、干燥保存法以及超低温保存方法等。根据需要保存菌种的不同，选择合适的保存方法，才能达到最佳的效果。在选择合适保藏方法的基础上，做好日常管理工作，才能够真正将微生物检验的作用发挥出来，为科学研究提供参考。

参考文献：

[1]   黄家乐，王玥，何睿，裘畅，徐雪娥.制药企业微生物实验室菌种保存方法的探讨[J].中国药事，2017，31（09）：1007-1011.

[2]   韩映晨，崔铉，安贤兰，高杰.浅谈药品微生物检验用菌种保藏方法[J].中国卫生标准管理，2017，8（20）：104-106.

[3]   费嫦，桂芳，李争鸣，王林.医学微生物实验室四种菌种保存方法的比较[J].医学理论与实践，2017，30（12）：1827-1829.

[4]   张竞帆.Bacillus mojavensis B1811与Burkholderia pyrrocinia B1213降解邻苯二甲酸酯的特性与途径研究[D].2018.

[5]   戴宇婷，刘自昭.药品检验常用标准菌种的斜面保藏方法研究[J].中国卫生标准管理，2019，010（005）：69-71.

[6]   徐玲玲，张丹丹，张焱.两种微生物菌肥细菌菌种分离、鉴定及活性研究[J].辽宁农业科学，2019，000（001）：22-25.

[7]   赵嘉宁.农业微生物资源在国家经济及生态环境建设中的重要作用[J].江西农业，2018，No.137（12）：93.

作者简介：

赵青（1988年5月），性别：女，籍贯：陕西宝鸡，职称：助理工程师，学历：本科，研究方向：微生物发酵技术.