上海地区奶牛乳房炎病原菌的分离鉴定及耐药性分析

朱宁，赵艳坤，陈贺，王富兰，王帅，李应彪

（1.石河子大学食品学院，石河子 832003；2.新疆农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，农业农村部农产品质量安全风险评估实验室（乌鲁木齐），新疆农产品质量安全实验室，乌鲁木齐 830091）

乳房炎是奶牛最常见的疾病之一，该病成因复杂、发病率高[1]且较难治愈，造成经济损失严重，给奶业健康发展带来巨大挑战[2～4]。目前，对奶牛乳房炎的防制仍以抗生素治疗为主，从而造成了药物残留等问题。此外，在临床治疗过程中由于盲目使用或滥用抗生素，致使耐药菌株不断产生，给临床防治带来巨大的困难，严重威胁着我国的动物性食品安全[5～7]。奶牛乳腺发炎的成因复杂，病原微生物感染、物理性损伤和化学物质刺激等都会引起其发生，其中病原微生物尤其是细菌病原体的入侵感染是引发奶牛乳房炎的主要病因。冯小慧等对2017年上海、河北地区奶牛乳房炎进行细菌分离鉴定及耐药性分析，得出该地区乳房炎与克雷伯氏菌感染密切相关，且存在不同程度耐药性[8]。易明梅等对上海地区奶牛乳房炎主要病原菌进行分离鉴定及耐药性分析，得出该地区奶牛乳房炎以金黄色葡萄球菌的单独感染以及金黄色葡萄球菌和无乳链球菌混合感染为主[9]。赵高乾等指出金黄色葡萄球菌是公认的奶牛乳房炎的主要传染性病原菌，无乳链球菌在中国感染率较高，大肠埃希氏菌作为主要环境性病原体，均普遍存在耐药性，其中，无乳链球菌对大部分抗生素仍旧敏感，治愈率较高[10]。由于地域、气候、奶牛生产管理手段的差异性，致使各地奶牛乳房炎病原菌感染情况也有所不同，目前奶牛乳房炎致病菌以大肠埃希氏菌、克雷伯氏菌属、链球菌以及金黄色葡萄球菌为主，且均存在不同程度的耐药性[11]。本研究以上海地区乳房炎患牛为研究对象，从牧场采集患病牛乳样，同时进行细菌分离鉴定，并对主要病原菌进行药敏试验及耐药性分析。通过对上海地区56个牧场临床型乳房炎奶样中的致病菌进行分离培养、革兰氏染色镜检、生化鉴定，并对主要病原菌分离株进行体外药物敏感性试验和耐药性分析，以减少抗生素的误用、滥用、过用和残留，以期为疫苗研制、敏感药物筛选以及奶牛乳房炎的预防和临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

培养基与试剂：鲜血琼脂、麦康凯琼脂、甘露醇高盐琼脂，购自北京陆桥技术股份有限公司；哥伦比亚血琼脂，购自上海科玛嘉微生物技术有限公司；细菌微量生化鉴定管（兔血浆）、葡萄糖、3%过氧化氢、甘露醇、山梨醇、七叶苷、尿素酶、靛基质、西蒙氏枸橼酸盐、三糖铁，购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；40%胆汁培养基、蕈糖、马尿酸盐，购自广东环凯生物科技有限公司；革兰氏染液，购自新疆宝信源柏生物技术有限公司。

药敏板：革兰氏阴性定制药敏板、革兰氏阳性定制药敏板，购自天津市金章科技发展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 样品的采集

71份样品采自上海市崇明区、奉贤区、浦东新区、金山区、嘉定区和江苏省苏州市、泰州市56个不同规模牧场乳房炎患牛的混合奶样。各取50mL于无菌采样瓶中，标记，冷藏，24h之内送回实验室进行细菌分离。

1.2.2 细菌分离与纯化

将乳样摇匀，无菌操作，用接种环取2～3环待检乳样，间断划线接种于血琼脂平板、麦康凯琼脂平板、甘露醇高盐琼脂平板上，在37℃恒温箱中培养18～48h，肉眼观察菌落的生长状态和菌落形态，挑取典型菌落，划线纯化，对其进行唯一性编号。

接着对典型单个菌落进行革兰氏染色镜检，根据菌落形态及染色特征初步判定细菌类属，并将其进一步纯化培养。

1.2.3 细菌的生化鉴定

将分离纯化的细菌分类增菌后，分别进行生化鉴定。包括凝固酶试验，甘露醇、山梨醇和七叶苷发酵试验，枸橼酸盐利用试验、糖类试验、靛基质试验、H2S试验等。

1.2.4 药敏试验

对分离的金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、大肠杆菌和克雷伯氏菌4种目标菌株进行药物敏感性试验，并按照美国临床实验室标准委员会（CLSI）推荐的微量肉汤稀释法进行细菌最小抑菌浓度（MIC）值测定。

2 结果与分析

2.1 细菌的分离结果

经对71份临床型乳房炎奶样进行生化鉴定，鉴定出目标菌：金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、大肠杆菌和克雷伯氏菌。粪肠球菌的分离率是7.0%（5/71），克雷伯氏菌的分离率是11.3%（8/71），大肠杆菌的分离率是15.5%（11/71），金黄色葡萄球菌的分离率是16.9%（12/71），其中金黄色葡萄球菌是公认的奶牛乳房炎的主要传染性病原菌，分离率最高（表1）。由此可见，金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、大肠杆菌和克雷伯氏菌为该地区奶牛乳房炎的主要致病菌，主要患病途径是细菌传染。

表1 细菌的分离结果 单位：份，%

2.2 各菌药敏试验结果

药敏试验结果显示，上海地区分离的12株金黄色葡萄球菌对15种抗菌药物均表现高度敏感，敏感率达91.7%～100.0%，对15种临床常用抗菌药物的耐药性较低甚至无耐药产生（表2）。

表2 分离的12株金黄色葡萄球菌对常见的15种药物药敏试验结果

上海地区分离的5株粪肠球菌对氨苄西林、阿莫西林-克拉维酸、头孢噻呋、多西环素、利福平、万古霉素、环丙沙星、磺胺异唑和复方新诺明的敏感率较高，达60%～100%，对头孢噻吩完全耐药，耐药率100%，其次是青霉素、苯唑西林、红霉素、克林霉素和庆大霉素，耐药率均为60%（表3）。

表3 分离的5株粪肠球菌对常见的15种药物药敏试验结果

上海地区分离的11株大肠杆菌对阿莫西林-克拉维酸、头孢噻呋、美罗培南、链霉素、卡那霉素、庆大霉素、四环素、多西环素、氟苯尼考、多黏菌素E、利福平、环丙沙星、磺胺异唑和复方新诺明表现高度敏感，敏感率达63.6%～100%，仅对头孢噻吩表现出耐药，耐药率达72.7%（表4）。

表4 分离的11株大肠杆菌对常见的15种药物药敏试验结果

上海地区分离的8株克雷伯氏菌对头孢噻呋、美罗培南、链霉素、卡那霉素、氟苯尼考、多黏菌素E和环丙沙星的敏感性较高，敏感率达62.5%～100%，对氨苄西林、庆大霉素、四环素、磺胺异唑和复方新诺明表现耐药，耐药严重程度为氨苄西林=磺胺异唑=庆大霉素（75%）＞四环素（62.5%）＞复方新诺明（50%），见表5。

2.3 多重耐药结果

由上海地区分离的金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、大肠杆菌和克雷伯氏菌4种菌的多重耐药结果显示，金黄色葡萄球菌无多重耐药情况，粪肠球菌对3种、4种、5种和6种药物多重耐药，大肠杆菌对3种、6种和9种药物多重耐药，克雷伯氏菌对5种、6种、8种和10种药物多重耐药；大肠杆菌和克雷伯氏菌多重耐药的情况比较严重，对9种、10种抗菌药物多重耐药（图1）。

图1 多重耐药结果

3 讨论

乳房炎是奶牛养殖业的常见病[12]，会造成产奶量下降、奶品质降低，进而影响人体健康，严重制约着奶牛养殖业的发展。本试验通过对采集的71份乳房炎患牛奶样进行分离鉴定，显示引起上海地区奶牛场奶牛乳房炎的主要病原菌为金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、大肠杆菌和克雷伯氏菌，这与国内易明梅等对上海地区的分析结果存在一定的差异[9]，表明同一地区、不同奶牛场之间，引起奶牛乳房炎的主要病原菌的比率有所不同，这可能与各奶牛场的饲养管理习惯、抗生素的选用以及样品采集季节的不同有一定关系。

综合分析发现，4种主要病原菌对头孢噻吩、氨苄西林、磺胺异唑均表现不同程度的耐药，耐药率高达75.00%～100.00%，对头孢噻呋、环丙沙星、阿莫西林-克拉维酸抗菌药物敏感，敏感率在60.0%～100.0%，这与国内贾智丽等对包头地区的分析结果[13]大致相同。薛梅等[14]对山东省潍坊市奶牛场病原微生物的分析结果显示，主要病原菌对头孢噻呋抗菌药物较敏感，这与本试验结果基本一致，推测可能与奶牛场管理不合理[15,16]，在临床治疗乳房炎时未能及时进行细菌分离鉴定，通过药敏试验选择敏感药物有关。因此，环丙沙星及头孢噻呋抗生素可在一定时期内作为上海地区乳房炎治疗的首选药物。头孢噻吩、氨苄西林、磺胺异唑可为淘汰用药。

从多重耐药性的结果分析，多重耐药菌株共16株，占22.5，存在对9、10种抗菌药物耐药，这同高晓伟等对长春地区奶牛乳房炎病原菌的耐药性评估中存在多重耐药，甚至存在对5～10种抗生素耐药的情况[17]保持一致，这与不合理使用抗生素，经常使用一种或几种抗生素、乱用、滥用等情况有关。因此，在防制乳房炎时应对症合理用药[18]，以达到早发现早治疗的目的，减少多重耐药性的产生。

目前治疗奶牛乳房炎的主要方法还是应用抗生素，但即使科学、靶向用药，长期的抗生素使用也会使得传统药物的作用效果下降，药物残留也致使乳制品质量下降，危及人类健康。因此，应积极研究奶牛乳房炎的其他有效治疗方法，如中药疗法、中西医结合疗法、基因疗法、生物疗法、物理疗法等，为奶牛乳房炎的治疗提供新的思路[19,20]。

4 结论

通过对上海地区部分奶牛场71份临床型乳房炎患牛奶样进行细菌分离鉴定，并对主要病原菌进行药敏试验，显示该地区奶牛乳房炎的主要致病菌为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、粪肠球菌、克雷伯氏菌，这些病原菌对氨苄西林、磺胺异唑、庆大霉素具有较强耐药性；对头孢噻呋、环丙沙星、阿莫西林-克拉维酸抗菌药物敏感，上述研究结果可为上海地区奶牛乳房炎的防制提供可靠的理论依据。