卵巢癌腹水减低自然杀伤细胞与肿瘤细胞相互作用

何思思 吴金枝 张大权 王彦哲 苟小霞（通讯作者）

（1 遵义医科大学第二附属医院肿瘤科 贵州 遵义 563003）

（2 遵义医科大学第二附属医院放疗中心 贵州 遵义 563003）

卵巢癌作为全球高发的女性肿瘤之一，因其高死亡率严重威胁人类生命安全。约三分之二患者在确诊时已处于疾病晚期[1,2]。目前针对晚期卵巢癌主要治疗手段包括肿瘤细胞减灭术辅以化疗、放疗等综合治疗，但卵巢癌具有肿瘤异质性、高转移率、进展迅速等特征，且当前治疗手段中缺乏有效的维持治疗，大部分患者复发时肿瘤已获得耐药性[3,4]，最终导致治疗效果不佳，值得重视的是，超过三分之一的卵巢癌患者在诊断时已合并伴有腹腔积液，这也可作为肿瘤细胞腹腔转移的重要提示[5]。近年来研究证实，卵巢癌腹水与不良预后密切相关。作为肿瘤细胞“储备库”，腹水中免疫细胞和免疫调节因子同时参与促进肿瘤生长并抑制宿主免疫系统的过程[6]。转化生长因子β（T G F-β 信号）调节与浆液性卵巢癌的转移和存活不佳相关[7]。Puiffe ML 等报道了卵巢癌腹水促进肿瘤细胞增殖、侵袭转移[8]。Goncharenko-Khaider N 发现卵巢癌腹水通过明显增加肿瘤细胞Mcl-1 表达进一步通过ERK1/2-Elk-1 通路减弱TRAIL 诱导的细胞凋亡[9]。卵巢癌腹水中成分复杂，肿瘤细胞可能发生免疫逃逸。自然杀伤细胞（natural killer cell，简称NK）作为机体天然免疫的主要承担者，主要通过抑制性杀伤细胞免疫球蛋白样受体（K I R）和活化性受体N K G2D 调节杀伤肿瘤作用，但目前对于卵巢癌腹水环境中N K 细胞杀伤功能及活化性受体状态尚未明确。

1.材料与方法

1.1 收集本院妇科患者晚期卵巢癌腹水20 例。从健康志愿者抽取50ml 外周血液，利用淋巴细胞分离液进行梯度离心获得单核细胞群；根据磁性细胞分选技术NK Cell Isolation Kit 将细胞重悬至细胞浓度为10×107/ml。将培养好的NK 细胞用PBS 清洗3 次，平均加入两管10ml 玻璃管，在避光的条件下分别加入CD56 抗体，CD3 抗体，待20min 后用PBS 清洗两次后，上机检测。NK 细胞纯化指标：流式细胞仪检测指标：CD56+CD3 ≥95%。

1.2 分离出的NK 细胞使用特殊配置的培养基培养，每两天半量换液，培养7 天后铺板利用。培养48h 条件：RPMI4.5g/ml葡萄糖2mM 谷氨酰胺，10%人血清PAA，200U/ml IL-2，10ng/ml IL-15。培养1 周后收取细胞，弃上清，PBS 反复清洗三次将收集的细胞作下一步检测。

1.3 取患者腹水1500g，3min,离心两次后将细胞至于100mm 圆皿体外培，10% FBS RPMI-1640 培养基作为对照培养基。选取人卵巢癌细胞株SKVO3 传代。调整细胞浓度为1×105个细胞/ml 传代培养。过夜贴壁后更换离心后腹水作用72 小时后，再次传代重复上述步骤。培养1 周后收取细胞，弃上清，PBS 反复清洗三次将收集的细胞作下一步检测。

1.4 制作单细胞悬液置于2ml 圆底流式管中，离心，1500g，3min，用枪尖弃上清液，在流式管加入100ul PBS，轻柔重悬；加入PBS 1ml至流式管中，反复离心洗涤2次，弃去上清，轻柔重悬。流式细胞技术检测腹水对NK 细胞受体、CD107a、IFN-γ 变化。

2.结果

结果表明，经过磁珠分选N K 细胞纯度达到85%以上且稳定。通过卵巢癌腹水培养后，流式细胞术证实N K 细胞激活受体NKG2D 表达、IFN-γ 分泌及CD107a 水平受到明显抑制。

通过对腹水培养后NK 细胞受体、CD107a 脱颗粒、IFN-γ水平检测，进一步证实了卵巢癌腹水明显降低NK 细胞NKG2D受体表达（图1A），且IFN-γ 分泌、CD107a 表达水平降低，而对NKp44、NKp46 无影响（图1B）。

3.讨论

卵巢癌腹腔微环境中存在CD4+CD25+Treg，且其含量及免疫抑制功能较外周血PBMC 显著增高，提示卵巢癌腹腔内更易发生免疫逃逸作用[10]。其中自然杀伤细胞（natural killer cell，简称NK）作为机体天然免疫的主要承担者，主要通过抑制性杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIR）和活化性受体NKG2D 调节杀伤肿瘤作用，但目前对于卵巢癌腹水环境中NK 细胞杀伤功能及活化性受体状态尚未明确。

NK 细胞发挥细胞毒杀伤作用的方式是通过平衡激活性受体和抑制性受体的信号。NKG2D 受体家族与NK 细胞发挥激活功能密切相关。在NK 细胞，CD8+淋巴细胞和γδT 细胞表面，NKG2D受体均有表达。激活NKG2D 受体配体可特异性识别并杀伤肿瘤细胞。尽管自然杀伤细胞具有抗肿瘤作用，但卵巢癌腹水中NK 细胞杀伤机制是否得到有效激活尚未可知。

近来研究表明，给予外周血单个核细胞联合白介素-2 腹腔注射NSG 卵巢癌小鼠模型，结果发现外周血与腹膜腔中NK 细胞明显增殖，且NK 脱颗粒酶作用上调。这说明NK 细胞作为主要效应细胞在腹膜腔中发挥抗肿瘤作用。另一项研究证实体外扩增卵巢癌患者外周血来源及腹水来源的自然杀伤细胞对体原发性卵巢癌细胞和卵巢癌耐药细胞株表现出明显杀伤活性，这说明卵巢癌恶性腹水中的自然杀伤细胞在体外环境发挥抗肿瘤作用，但该研究未深入探究自然杀伤细胞在腹水环境中是否发挥杀伤功能。

更早期研究提示，卵巢癌腹水来源肿瘤细胞表达NK 相关的识别结构，但是对未受刺激的效应细胞的细胞溶解具有相对抗性目前研究并未对卵巢癌腹水影响肿瘤与自然杀伤细胞相互作用做更深一步探究，且国内外从基础研究角度对卵巢癌腹水诱导肿瘤细胞免疫逃逸及其机制研究尚少，开展这一研究对卵巢癌联合治疗策略研究具有重要意义。

本项目通过检测腹水培养后肿瘤细胞与自然杀伤细胞发现，以NKG2D 受体及配体为主的交互作用明显收到抑制，且NK 脱颗粒作用减低，杀伤活性明显减低。研究证实卵巢癌腹水环境中NK 细胞受到抑制主要与受体配体相互作用有关。但本实验为小样本实验，还需大样本来进一步验证。