吻鮈不同组织乳酸脱氢酶及酯酶同工酶研究

饶毅 徐先栋 王生 章海鑫 傅义龙

摘要：采用聚丙烯酰胺垂直梯度凝胶电泳法对采自赣江上游流域的吻鮈肝脏、脾脏、肌肉、肾脏、心脏和脑6 种组织中的乳酸脱氢酶和酯酶同工酶进行了研究。结果表明，吻鮈乳酸脱氢酶同工酶共检测到3条酶带，在肝脏、肾脏中检测到2条，其余组织中检测到1条。肌肉及脑组织中表达活性最高，其次为肾脏、肝脏、肾脏，心脏中表达最弱。吻鮈酯酶同工酶共检测到5条酶带，肾脏中检测到5条，肝脏中检测到4条，肌肉中3条，脾脏中2条，心脏中1条。肾脏中表达活性最高，其次为肝脏、脑、肌肉和脾脏，心脏中表达活性最弱。由结果可见吻鮈乳酸脱氢酶及酯酶分布具有组织特异性。

关键词：吻鮈;乳酸脱氢酶;酯酶;组织特异性

中图分类号：S937        文献标识码：A

吻鮈（Rhinogobio typus Bleeker）属于鲤形目、鲤科、鮈亚科、吻鮈属，我国特有种。俗称：秋子、长鼻白杨鱼、大鼓眼、铁桿鳅和鳅儿棒[1-2]。吻鮈为底层鱼类，是一种喜栖息于透明度较高、泥沙和碎石底质的缓流河口、湾沱内的底栖鱼类，一般2～3龄达到性成熟，产卵在流水滩上，浮性卵，顺水冲流。主要分布于长江干流及其支流，赣江也是主要分布水系。吻鮈生长较慢，个体不大，由于其含肉率高，肉质细嫩、营养丰富，必需氨基酸和鲜味氨基酸的含量高于一般的鱼类，具有较高的食用价值，深受人们喜欢，市场需求旺盛，为赣江主要捕捞经济鱼类之一。关于吻鮈的研究，主要集中在形态分类、物种分化方面以及生长和繁殖特性方面[3-5]。目前对吻鮈的种质资源研究较少，为此，本文利用聚丙烯凝胶电泳技术研究吻鮈的乳酸脱氢酶和酯酶，为吻鮈的种质资源利用提供参考。

1  材料与方法

1.1  材料

实验用吻鮈采自江西省峡江县赣江水域。鱼体体长约20 cm，体重90 g左右，充氧运输至实验室，并在玻璃缸中充气暂养，每天投喂饲料1次，暂养一周后，鱼状态正常，采样实验。

1.2  实验方法

1.2.1  酶液提取

取吻鮈肝脏、脾脏、肌肉、肾脏、心脏和脑6 种组织少许，双蒸水冲洗干净，滤纸吸干表面水分，置于离心管中，按1∶3 （W/V）加入0.1 mol/L的磷酸缓冲液（pH 7.0），首先使用消毒后的手术剪把组织剪成小块，然后再使用电动研磨器冰浴研磨成匀浆状。完成后于4℃下10000 r/min离心30 min，吸取上清液，-20℃储存，尽快用于电泳分析。

1.2.2  电泳

采用垂直平板不连续聚丙烯酞胺凝胶电泳法，电泳系统为NuPAGE Bis-Tris蛋白预制胶套装，包括invitrogen Mini Gel Tank 小型电泳槽，NuPAGE蛋白预制梯度凝胶（浓缩胶浓度为4%，分离胶浓度为12%）NuPAGE LDS Sample buffer缓冲液。20 μL样品与2 μL指示剂溴酚兰混合一起上样，首先使用80 V电泳至样品压缩成一细线并跑出浓缩胶后，调大电压至120 V继续进行分离胶电泳，当溴酚蓝的边缘到达凝胶底部时，停止电泳，整个电泳过程约30 min。

凝胶电泳完毕后立即取下，用双蒸水漂洗干净，置于染色液中于37℃染色，染色方法参照国标进行[6]，染色完成后，用双蒸水漂洗干净，保存于7%醋酸中。用数码相机及伯乐（Bio-Rad）凝胶成像系统（Gel Doc XR+）拍摄同工酶图谱。同工酶在各组织中的含量以条带粗细及颜色深浅来表示，条带粗、颜色深表示酶的含量高。

2  结果与分析

2.1  乳酸脱氢酶酶谱表型

吻鮈乳酸脱氢酶同工酶共检测到3条酶带，在肝脏、肾脏中检测到2条，其余组织中检测到1条（图1）。肌肉及脑组织中表达活性最高，其次为肾脏、肝脏、心脏，脾脏中表达最弱。

2.2   酯酶酶谱表型

吻鮈酯酶同工酶共检测到5条酶带，肾脏中检测到5条，肝脏中检测到4条，肌肉中3条，脾脏中2条，心脏中1条（图2）。肾脏中表达活性最高，其次为肝脏，脑，肌肉和脾脏，心脏中表达活性最弱。

3  讨论

（1）乳酸脱氢酶（LDH）是糖酵解过程中的关键酶之一，在氧气充足的组织中，如心脏中催化乳酸脱氢氧化为丙酮酸，参与三羧酸循环[7]，在厌氧器官组织中，如肝脏、肌肉组织中催化丙酮酸还原为乳酸。研究表明，鱼类LDH同工酶表达是由多基因决定的，一般由M和H蛋白亚基组成，有5种组合方式，表现为5条酶带，分布存在明显的组织特异性[7-8] 。吻鮈脑组织和肌肉组织中活性强，因为吻鮈生活在江河流水环境，时常保持游动状态，与之相适应运动组织肌肉和运动控制组织脑的酶活力强。此外，本次实验的吻鮈不同组织乳酸脱氢酶中，肌肉和脑组织中条带表达稳定，这两种组织可作为吻鮈种质鉴定的标志酶取样部位。

（2）酯酶（EST）属于水解酶类，能催化酯健水解，一般认为在硬骨鱼类中EST 为单体或二聚体，由多个基因位点编码，多态性现象普遍[9]。本研究结果也表明在吻鮈各组织中酯酶的分布具有多态性，同上述结论相似。本研究结果吻鮈中各组织酯酶表达活性也各不相同，同前人研究黄颡鱼体内酯酶结果相类似[10]。吻鮈酯酶在肝脏中表达活性最强，其次为肾脏。肝脏是重要的解毒器官，主要起解毒作用的就是酯酶，吻鮈肝脏中的酯酶含量丰富，与肝脏的解毒功能是相适应的。肾脏是机体重要的排泄器官，肝脏分解的有毒有害物质通过肾脏排出体外，因而与之相适应其酯酶同工酶亦表现出活力强的酶带。吻鮈肌肉组织功能想对单一，酶谱带表达稳定，如本研究吻鮈肌肉组织中3条酶带，表达稳定清晰，且具有特异性，可以作为吻鮈种质鉴定的酯酶标志酶取样部位。

参考文献

[1]施白南. 吻鮈的生物学[J]. 西南师范学院学报，1980，（2）：111-115.

[2]孙玉苗. 吻鮈属（Rhinogobio） 鱼类物种分化的研究[D]. 济南：山东大学，2008.

[3]Wang X Z， Liu H Z. Phylogenetic relationships of the Chinese cyprinid genus Rhinogobio Bleeker （ Teleostei： Cyprinidae） based on sequences of the mitochondrial DNA control region，with comments on character adaptations[J]. Hydrobiologia， 2005，532（1）：215-220.

[4] Wang M， Liu F， Lin P， et al. Evolutionary dynamics of ecological niche in three Rhinogobio fishes from the upper Yangtze River inferred from morphological traits [J]. Ecol Evol， 2015，5 （3）：567-577.

[5]常剑波，孙建贻 . 嘉陵江吻鮈生长和繁殖力研究[J]. 资源开发与保护，1991，（3）  ：146 -150.

[6]GB/T 18654.13-2008 养殖鱼类种质检验 第13部分：同工酶电泳分析.

[7]王镜岩，朱圣庚，徐长法. 生物化学（第三版上册）[M]. 高等教育出版社，2002：428-429.

[8] 徐钢春，董晶晶，聂志娟，等. 刀鲚不同组织的乳酸脱氢酶同工酶及DNA含量研究[J]. 上海海洋大学学报，2012，21（4）：481-488.

[9]吴少伟，张以顺，黎祖福. 云斑尖塘鳢不同组织同工酶的研究[J]. 湖北农业科学，2011，50（1）：136-139.

[10]李雅娟，赵兴文，毛连菊，等. 黄颡鱼几种组织的组织蛋白与酯酶同工酶电泳分析[J]. 东北农业大学学报，2004，35（3）：342-346.