恒河猴肺中阴沟肠杆菌的分离鉴定及药物敏感性分析

李艳艳,禹文海,杨凤梅,刘 权,陈丽雄,王俊斌,马 进,徐鸿界,杨亚平,赵 远,和占龙

(中国医学科学院/北京协和医学院 医学生物学研究所,云南省重大传染病疫苗研发重点实验室,昆明 650118)

阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)在自然界中广泛存在,在人和动物的粪便、水、泥土、植物中都可检出。 该菌为条件性致病菌,特定条件下能感染呼吸系统、泌尿系统等多个器官系统,同时也可感染创口,严重时引发败血症等[1]。 老年人和抵抗力降低的病人是该菌的易感人群。 该菌也可导致儿童脑膜炎、脑梗塞、脑脓肿和脑囊肿等疾病, 甚至引起死亡。 因此,阴沟肠杆菌已成为引起医院内感染的一种重要的病原菌。 另外,阴沟肠杆菌B29 是国际上公认的“肥胖细菌”,它是造成肥胖的直接元凶之一[2]。 大量研究报道,由于抗生素类药物的不合理使用,使阴沟肠杆菌对多种抗菌药物具有较高的耐药性[3-4],阴沟肠杆菌普遍对第一代至第四代头孢类、青霉素类等药物有90%以上的耐药率,这为临床用药的选择带来很大困难。 经过多年对恒河猴的饲养观察发现,恒河猴呼吸系统疾病发病率高,严重时可引起死亡。 本文首次在恒河猴的肺组织中分离到阴沟肠杆菌,通过药物敏感性试验,确定治疗阴沟肠杆菌的首选药物,为今后的临床治疗工作提供依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

普通级雄性恒河猴1 只,8 岁,体重约7 kg。 健康KM 小鼠10 只,雌性,6 ～8 周龄。 恒河猴及KM小鼠均来源于中国医学科学院医学生物学研究所医学灵长类研究中心(恒河猴生产许可证号[SCXK(滇) K2015-0004],使用许可证号[SYXK (滇)K2015-0006];KM 小鼠生产许可证号[SCXK (滇)K2014-0002],使用许可证号[SYXK (滇) K2014-0007])。 实验内容经本单位动物实验伦理审查委员会审查通过(批准号:DWSP201902034),实验过程按实验动物使用的3R 原则给予实验动物人道的关怀。

1.2 主要试剂与仪器

SS 琼脂(青岛日水生物技术有限公司,批号20140522)、GN 增菌液(青岛日水生物技术有限公司,批号20140215)、三糖铁琼脂(青岛日水生物技术有限公司,批号20140331),ID 32 E 生化鉴定试条(梅里埃公司),药敏纸片(北京天坛生物技术开发有限公司)。 电热恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)、ATB Expression 仪(法国梅里埃公司)。

图1 恒河猴病变Figure 1 The lesions of rhesus monkey

1.3 实验方法

1.3.1 病例资料

该恒河猴身体健康,由人工饲养,每日喂以基础饲料[5],自由饮水。 每日清洗猴笼,定期消毒。通过日常饲养观察发现该恒河猴表现为呼吸困难,精神沉郁,厌食,活动减少等症状,立即转入治疗室单笼饲养及治疗,静脉输液青霉素(80 万单位/次)3 d 后病情好转,停药观察,该猴精神及饮食情况并未完全恢复。 在治疗室内隔离观察20 d 后放回大笼饲养,于放回大笼第2 天死亡。 尸检外观可见腹部鼓气(见图1A),解剖心脏、肝、脾、胰腺、肾、肾上腺、膀胱未见异常,胃、肠管内充气(见图1B),部分肠道呈出血性炎性变化,双肺下呈充血、出血,边缘部分肉样肺炎病变(见图1C)。

1.3.2 病料采集及培养

解剖柜条件下解剖死亡猴,用无菌手术剪切开肺组织,用灭菌接种环在肉眼病变明显和正常肺组织部位采样,接种于GN 增菌液,在恒温培养箱(37℃)内增菌8 h 后,接种SS 琼脂培养基,将平皿倒置放于37℃恒温培养箱中培养18 ～24 h 后观察结果。

1.3.3 细菌分离培养

挑选SS 琼脂培养基上典型菌落穿刺接种于三糖铁琼脂鉴别培养基,置于37℃恒温培养箱中培养18～24 h,作进一步的分离培养和产酸产气等培养特征的鉴定。 同时挑取单个菌落进行革兰氏染色,镜检。

1.3.4 细菌生化鉴定

细菌生化鉴定采用法国生物梅里埃公司ATB细菌鉴定系统及配套ID 32E 鉴定卡。 按照说明书,在鉴定卡中加入样品后放37℃培养箱内培养,18 ～24 h 内观察生化反应结果。 将反应结果编号输入ATB 鉴定系统,判定结果。

1.3.5 药敏试验

用纸片扩散法,对分离到的细菌进行常用抗菌类药物的敏感性试验。 平皿置于37℃培养24 h 后取出,观察并测量抑菌圈直径大小(mm)。 结果判定按美国CLSI 的抗微生物药物敏感性试验操作方法和判断标准进行[6]。 所用8 种药敏试纸片如下表。

表1 药敏纸片及规格Table 1 Specification of drug-sensitive paper

1.3.6 病理检查

取肉眼见明显病变部位,4%甲醛溶液固定后制作病理切片,HE 染色,镜检。

1.3.7 小鼠致病性试验

用灭菌生理盐水将分离纯培养的细菌稀释,ATB 比浊仪调整菌液浓度为4 McF。 设立实验组和对照组,实验组6 只小鼠,腹腔注射菌液0.5 mL/只,对照组4 只小鼠,腹腔注射灭菌生理盐水0.5 mL/只。 记录发病及致死情况,解剖死亡小鼠,记录病理变化,无菌条件下采集肺脏组织进行细菌分离培养。

2 结果

2.1 菌落特性

细菌经培养在SS 培养基上生长成湿润、表面光滑、白色或乳白色、不透明的圆形菌落(如图2A),革兰氏染色镜检,可见革兰氏阴性小杆菌(如图2B)。

图2 恒河猴肺组织分离菌菌落及菌体形态Figure 2 Colony and bacterial morphology from lung in rhesus monkey

2.2 生化特性

三糖铁培养基分离培养,该菌产酸产气。 将ID 32E 鉴定卡反应结果编号输入ATB 鉴定系统,判定该细菌为阴沟肠杆菌, ID 为99.9%,T 为0.71,ID编码35074753311,生化结果见表2。

2.3 药物敏感性试验

阴沟肠杆菌药敏试验测得的抑菌圈直径大小见表3。 从表中可看出该菌对氨苄西林、头孢呋辛中等敏感;对诺氟沙星、阿米卡星、庆大霉素、头孢曲松、头孢哌酮、头孢噻肟敏感。

2.4 病理结果

肺部病变明显部位制作病理切片,镜检可见肺内炎性肉芽肿形成(图3A),泡沫细胞聚集,血管支气管周围淋巴细胞浸润(图3B)。

表2 细菌生化特性检测结果Table 2 Detection results of biochemical characteristics

2.5 小鼠致病性试验

实验组小鼠于接种菌液后5 h 出现活动减少、精神萎靡、闭目、呼吸急促等临床表现,19 h 内全部死亡,解剖可见肺叶出血、胃肠鼓气、十二指肠肠壁变薄等病变(如图4A、4B)。 取病变肺脏组织进行细菌培养,分离出阴沟肠杆菌,表明该株阴沟肠杆菌对小鼠有较强的致病性。 对照组小鼠行为表现及剖检情况均正常(如图4C)。

3 讨论

阴沟肠杆菌属肠杆菌科肠杆菌属,是条件致病菌,通常在人和动物的肠道内寄生。 如朱旗[7]等发现在赛马肠道菌群中存在阴沟肠杆菌,黄小兰[8]等从圈养滇金丝猴粪便中分离到阴沟肠杆菌。 近年来阴沟肠杆菌备受关注是因为其引发的呼吸系统感染疾病日益增多。 大量研究表明,某些严重的基础疾病如烧伤、手术创伤、恶性肿瘤等,以及实施气管切开、导尿、静脉插管等侵入性诊疗操作,都能破坏机体免疫屏障结构,造成免疫功能降低;另外激素等免疫抑制剂、化疗药物、抗生素的大量应用及不适当的联合用药抑制了正常菌群,使机体内的正常菌群大量减少,导致阴沟肠杆菌等条件致病菌增多并大量繁殖成为优势菌种[9],并定位移植到肠外的其他器官系统,感染部位主要是下呼吸道和泌尿道[10]。 目前,对人类由阴沟肠杆菌引起的疾病研究较多,动物方面也较常见。 如阴沟肠杆菌引起呼吸系统疾病的报道,包扣大熊猫呼吸道、七彩山鸡肺脏、亚洲黑熊肺脏、绵羊肺部、牛肺脏感染[11-13];另有阴沟肠杆菌引起孔雀胚死亡、罗氏沼虾幼虾死亡、与马链球菌兽疫亚种混合感染引起的马出血性败血症等报道。 但未见恒河猴感染的有关报道。本文中该恒河猴由治疗室转出后突然死亡,可能是由于治疗室与饲养大笼温差较大,且突然改变环境引起的。 病理变化主要为呼吸系统和消化系统,与由阴沟肠杆菌单独感染引起的绵羊肺炎的病理变化,如肺尖叶、心叶、隔叶呈不同程度的出血、充血及肝变,消化道表现为轻重不同的卡他性和出血性炎症变化基本一致[14]。 恒河猴腹泻及肺炎是常见病与多发病,严重者导致死亡。 本文从死亡恒河猴肺中分离到阴沟肠杆菌,这可能与恒河猴腹泻时抵抗力下降以及不适当的使用广谱抗菌药物,致使恒河猴体内菌群失调,导致阴沟肠杆菌从消化道移位到呼吸系统有关。 另外也可能与院内获得性感染有关,随着住院时间的延长,恒河猴与病原微生物接触的机会增加,危重情况下更易感染阴沟肠杆菌。 因此入院后应隔离治疗,避免交叉感染。

阴沟肠杆菌与铜绿假单胞菌、鲍曼氏不动杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌是引起下呼吸道感染的主要革兰阴性肠杆菌。 阴沟肠杆菌的耐药机制较为复杂,包括作用靶点的改变、主动外排活跃和外膜蛋白缺失、整合子、qnr 基因介导、产生β-内酰胺酶等,其中产超广谱β-内酰胺酶是肠杆菌科细菌最主要的耐药机制。 长期使用大量的抗菌药物会引起细菌耐药和交叉耐药,造成临床治疗失败,使临床感染治疗面临潜在威胁[15-16]。 本研究中阴沟肠杆菌对8 种所试抗菌药物均敏感,未出现耐药的情况,这可能与治疗时间较短有关系。 在我国兽医临床治疗过程中,滥用抗菌药物的现象极为普遍,仅凭经验长期大量的使用广谱抗菌药物会引起动物体内菌群失调,导致阴沟肠杆菌感染及耐药性的产生。 因此在实际工作中,为了有效控制该菌所致的各种感染,要做到以下几点:首先,采取有效的隔离措施,及时、正确治疗严重的基础疾病,做到早发现早隔离早治疗;其次避免或缩短侵入性操作,降低阴沟肠杆菌侵入性感染的机率;同时加强抗菌药物的流通管理工作,根据药敏试验选用抗菌药物,合理使用抗生素和激素,减少阴沟肠杆菌耐药性的产生;最后做到彻底消毒灭菌,避免阴沟肠杆菌的散播。

本研究中,从死亡恒河猴肺中分离到阴沟肠杆菌,该株阴沟肠杆菌对小鼠具有较强的致病性。 药敏试验结果表明阴沟肠杆菌对头孢哌酮、头孢噻肟最敏感,这为今后发现相同疾病的临床治疗工作提供一定的理论依据。

表3 阴沟肠杆菌药敏试验结果Table 3 Susceptibility test results of pneumonia pathogenic bacterium in rhesus monkey

图3 恒河猴肺组织病理改变(HE 染色,× 100)Figure 3 Pathological changes of lung in rhesus monkey. HE staining

图4 小鼠病变Figure 4 The lesions of mice