西藏自治区马铃薯地方品种遗传多样性分析

祁驰恒，许娟妮，尼玛卓嘎，曾钰婷

（西藏自治区农牧科学院蔬菜研究所，西藏 拉萨 850032）

马铃薯是西藏自治区继青稞、小麦之后的第三大粮食作物，是重要的粮菜兼用和工业原料作物，马铃薯产业在脱贫攻坚、农牧民增收、农业结构调整等方面具有重要的作用[1]。西藏自治区马铃薯主栽品种仍以地方品种为主，存在品种单一、退化严重等问题，迫切需要加强种质资源的开发与利用，选育与引进高产、高抗、优质、适宜西藏自治区生态条件的马铃薯新品种，以促进马铃薯产业健康发展。因此，明确西藏自治区马铃薯地方品种的遗传多样性、遗传差异，对新品种引进与新品种选育过程中的亲本选配具有重要意义。

随着高通量测序技术的发展，基因分型的成本持续降低，基因测序分型（Genotyping-by-sequencing，GBS）技术作为第二代深度测序基础上发展起来的简化基因组测序技术，通过采用酶切加标签的方法，使多样本高通量平行测序得以实现[2,3]，目前，GBS技术已在遗传学研究、图谱构建和种质鉴定等领域广泛应用[4,5]。国内对马铃薯遗传多样性分析报道较多，而针对西藏自治区马铃薯遗传多样性研究则鲜见报道[6-8]。本研究利用GBS技术对西藏自治区24份马铃薯地方品种和1个主栽品种的遗传多样性展开研究，以揭示西藏自治区马铃薯地方品种的亲缘关系及遗传特性，探讨其遗传多样性水平，为西藏自治区马铃薯种质资源开发与利用、新品种引进与选育提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为24个西藏自治区地方品种和1个主栽品种（‘青薯9号’），见表1。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取和GBS文库构建

每个供试品种选取5 株，共125 个样本。利用天根生化科技有限公司的基因组DNA 提取试剂盒（DNAsecure Plant Kit）提取DNA。经浓度及纯度检测后的高质量DNA 用于GBS 文库的构建和测序，采用限制性内切酶PstI-HF/MspI对DNA进行酶切，酶切后的片段两端用T4 连接酶加接头和Barcode，回收300～500 bp的DNA片段，对回收片段使用高保真酶进行PCR 扩增，使用Qubit 测定PCR 产物浓度，浓度需大于5 ng/μL，将混好的文库上机（Illumina Hiseq Xten，PE150）测序。

1.2.2 SNP鉴定

为了保证分析质量，将混池下机Raw Reads使用FastQC（v0.11.7）软件对多样品混池下机Raw Reads 进行质控；使用了Stacks（v2.1）软件包中的process_radtags程序（主要参数-r--renz_1--adapter_mm 1），剔除混池下机Raw Reads 含有接头序列的Reads，并依据建库样品与Barcode 对应关系拆分为单样品 Raw Reads；使用 FASTX Toolkit（v0.0.14）软件包中的fastx_trimmer 程序（主要参数-f-l），移除酶切位点序列以及3' 端FastQC 质控质量分数小于20 的所有碱基，得到Clean Reads。使用Bowtie2 软件将Clean Reads 比对到参考基因组上（http://solanaceae.plantbiology.msu.edu/data/potato_dm_v404_all_pm_un.fasta.zip），基于样品与参考基因组的比对结果，利用GATK软件HaplotypeCaller程序生成每个样品中的gVCF 文件，再通过GATK 软件GenotypeGVCFs 程序进行群体单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNP）检测。对得到的群体SNP 数据使用GATK 软件SelectVariants 程序对预测结果进行筛选。为了降低SNP和INDEL检测的错误率，使用VCFtools 软件对获得SNP 和INDEL分型结果进行过滤。过滤条件如下：Reads 支持数（DP）不低于4；剔除MAF 小于0.01 的位点；剔除SNP或者INDEL分型缺失率高于20%的位点。

表1 试验材料Table 1 Test materials

1.2.3 遗传数据统计

期望杂合度（He）、多态信息含量（PIC），有效等位基因数（Ne）分别由以下公式计算获得：

式中xi2为第i 个等位基因的频率，k 为等位基因数。

式中 i，j 为第 i、j 个等位基因；Pi和 Pj分别为群体中第i 个和第j 个等位基因频率，n 为等位基因数。

式中Pi为第i个有效等位基因的频率，n为等位基因数。

采用VCFtools 软件计算核苷酸多样性（Pi）、计算哈温平衡P 值，使用R 包Genepop 计算群体间的遗传分化系数（Fst），群体间的Reynolds'遗传距离（Reynolds'genetic distance，DR）则由 Fst 估算得出，DR=-ln（1-Fst）。采用邻接法（Neighbor-joiningmethod）构建进化树，通过TreeBeST软件计算距离矩阵，进化树的可靠性通过Bootstrap 法进行检验（重复1 000次），使用Plink2 软件对获得的SNP 标记进行PCA分析。

2 结果与分析

2.1 测序质量

GBS测序得到的原始图像数据文件经碱基识别分析转化为原始测序序列，125个马铃薯样本的总测序数据量为140.64 Gb，去除低质量的序列后，产生的高质量序数据量为130.22 Gb，平均每个样本数据量为1 042 Mb，测序质量较高（Q20 ≥94.63%，Q30 ≥87.16%），GC含量分布正常。全部样本与参考基因组的比对率为76.0%～85.39%，平均测序深度为56.26×，覆盖度为1.05%～3.08%。经过SNP calling 并过滤，共获得93 435 个SNP 位点，4 653 个 INDEL 位点。

2.2 供试品种遗传多样性

25个马铃薯品种的观测杂合度（Ho）为0.24，期望杂合度（He）为0.19，与Ho 相差不大。观测等位基因数（Na）为2，有效等位基因数（Ne）为1.29，多态性信息含量（PIC）为0.16，核苷酸多态性（PI）为0.19，哈温平衡P值为0.61，P ＞0.05说明达到了遗传平衡。

2.3 品种间遗传分化和遗传距离分析

由表2 可知，各品种间Fst 值小于0.05 占10%，0.05～0.15 的占5%，0.15～0.25 的占36%，大于0.25的占49%。品种间分化系数Fst值越低对应遗传距离越近，Fst值越高则对应遗传距离越远。‘艾玛白’、‘拉多’、‘琼林白’、‘察隅’、‘普兰科白’、‘亚东’、‘赛帮白’和‘洛扎’8 个品种间Fst 值在0.000 6～0.005 4，‘艾玛白’与其他17个品种的Fst值在0.206 8～0.301 4，‘青薯9 号’与其他品种的Fst值在0.155 8～0.246 0，平均为0.218 9，‘陈塘红’与其他品种的Fst值在 0.215 6～0.316 7，平均 Fst 值最高，为 0.289 4。‘陈塘红’（0.289 4）、‘芒康’（0.271 1）、‘下亚东’（0.252 6）、‘普兰科红’（0.257 8）、‘艾玛红’（0.267 9）、‘工布’（0.269 0）、‘昌果红’（0.278 1）、‘吉隆吉普’（0.268 6）、‘吉德秀’（0.272 8）和‘米林’（0.263 1）10个品种的平均Fst 值大于0.25，遗传距离DR 值在0.291 9～0.342 5。‘艾玛白’（0.172 2）、‘拉多’（0.172 1）、‘琼林白’（0.171 8）、‘察隅’（0.173 0）、‘普兰科白’（0.173 1）、‘亚东’（0.172 5）、‘赛帮白’（0.172 8）和‘洛扎’（0.173 3）8个品种的平均Fst值小于0.18，DR值在0.197 9～0.199 7。‘隆子切巴’和‘觉拉’的平均Fst 值分别为0.180 5 和0.189 9，其他5 个品种的平均Fst值在0.20～0.25，DR值在0.240 2～0.253 6。

2.4 进化树分析

arieties me v so R）etween（D) b离距遗istance (DR传st）和（F数genetic d系化分遗传t (Fst) and的间种efficien品co分部2表ifferentiation etic d en ble 2 G Ta红 C h a n g g u o h ong 果昌布G o n g b u 工红 E m m y h o n g 玛艾东Y a d o n g 亚龙D u i l o n g 堆红 P u l a n k e h o n g 科兰普林M i l i n 米东 X i a y a d o n g 亚下白 P u l a n k e b ai科兰普隅C h a y u 察白 Q i o n g l i n b ai 林琼康M a n g k a n g 芒多L a d u o 拉白 C h a g u o b a i 果查种V a r i e t y 品0.371 1 0.345 6 0.331 4 0.344 2 0.347 7 0.347 3 0.342 3 0.368 5 0.324 8 0.365 1 0.346 2 0.319 7 0.306 7-0.303 7 0.299 1 0.292 4 0.263 2 0.291 8 0.247 3 0.194 8 0.303 0 0.163 3 0.249 5 0.292 3 2 4 0.36 9 5 0.33 5 3 0.31 9 7 0.33 2 1 0.34 1 9 0.34 0 9 0.31 0 6 0.35 1 7 0.33 7 1 0.35 1 2 0.34 0 9 0.32-4 1 0.26 6 8 0.27 8 8 0.29 9 4 0.28 8 1 0.24 9 0 0.28 0 4 0.24 1 8 0.10 4 2 0.31 3 0 0.18 2 5 0.22 9 1 0.28 5 3 0.33 8 4 0.32 3 5 0.33 8 1 0.32 0 6 0.33 0 3 0.33 8 3 0.31 9 8 0.33 9 1 0.30 0 5 0.33 9 5 0.32-4 5 0.27 3 6 0.27 0 3 0.29 5 6 0.28 0 6 0.28 2 6 0.24 1 0 0.28 4 7 0.23 7 6 0.18 4 8 0.30 8 8 0.17 4 9 0.23 0 4 0.28 6 1 0.15 1 1 0.00 3 2 0.33 0 8 0.00 1 7 0.00 2 5 0.00 4 2 0.29 9 2 0.29 5 8 0.30 3 6 0.15-0 7 0.28 9 1 0.28 2 6 0.29 7 3 0.26 6 2 0.27 2 7 0.00 8 9 0.22 2 7 0.00 8 4 0.21 0 4 0.20 2 3 0.30 7 0 0.20 7 9 0.21 0 6 0.00 0.002 7 0.153 9 0.339 8 0.153 7 0.154 0 0.155 1 0.309 4 0.315 0 0.316 6-0.142 4 0.281 4 0.300 3 0.305 9 0.283 6 0.290 5 0.144 1 0.232 0 0.142 1 0.232 3 0.206 5 0.312 9 0.211 2 0.222 1 0.142 5 0.320 6 0.305 0 0.326 1 0.304 2 0.307 1 0.306 5 0.322 8 0.332 0-0.271 4 0.263 5 0.265 9 0.282 3 0.277 3 0.297 1 0.292 9 0.263 1 0.234 9 0.263 4 0.237 1 0.141 4 0.306 8 0.155 8 0.207 6 0.262 7 0 8 0.32 8 3 0.29 1 6 0.34 7 6 0.29 9 3 0.29 1 2 0.30 8 3 0.30-2 5 0.28 0 2 0.27 8 6 0.25 8 1 0.28 5 7 0.29 8 2 0.30 6 6 0.26 9 8 0.27 8 9 0.25 4 2 0.23 8 5 0.25 4 3 0.23 3 9 0.20 0 4 0.31 1 2 0.21 2 7 0.23 8 2 0.25 0.314 3 0.294 0 0.318 7 0.292 8 0.295 0 0.295 4-0.265 3 0.275 9 0.266 1 0.254 9 0.272 6 0.267 2 0.289 9 0.271 8 0.274 2 0.255 0 0.222 0 0.255 5 0.169 4 0.186 5 0.299 4 0.197 1 0.221 8 0.254 6 0.157 0 0.002 2 0.333 7 0.001 3 0.002 0-0.255 8 0.260 1 0.264 0 0.143 7 0.002 5 0.281 3 0.289 6 0.293 4 0.267 9 0.277 7 0.001 7 0.229 6 0.005 4 0.218 1 0.200 0 0.302 9 0.207 1 0.218 5 0.000 7 6 4 0.15 1 3 0.00 3 4 0.33 2 1 0.00-2 0 0.00 5 5 0.25 8 7 0.25 4 4 0.26 2 7 0.14 1 7 0.00 1 5 0.28 9 7 0.28 3 7 0.29 7 7 0.26 6 9 0.27 2 3 0.00 9 1 0.22 4 3 0.00 9 1 0.21 0 6 0.20 2 7 0.30 7 9 0.20 9 0 0.21 1 5 0.00 5 4 0.15 0 9 0.00 1 4 0.33-2 1 0.00 1 3 0.00 3 8 0.25 7 4 0.25 23 0 0..12 46 2 5 0 8 0.00 9 7 0.27 8 0 0.28 1 2 0.29 5 6 0.26 5 3 0.27 1 8 0.00 7 7 0.22 4 7 0.00 7 4 0.21 8 9 0.19 1 0 0.30 6 2 0.20 6 8 0.21 1 5 0.00 0.345 9 0.331 6-0.282 1 0.283 5 0.283 7 0.272 9 0.289 4 0.278 3 0.288 1 0.283 4 0.283 6 0.270 4 0.282 1 0.298 2 0.293 5 0.282 9 0.239 2 0.283 2 0.244 8 0.189 9 0.311 9 0.195 1 0.212 0 0.282 5 5 4 0.15-2 2 0.28 0 9 0.00 1 3 0.00 2 2 0.00 4 7 0.25 7 9 0.25 2 9 0.26 2 6 0.14 1 1 0.00 9 9 0.27 7 9 0.28 2 2 0.29 6 6 0.26 5 6 0.27 2 2 0.00 8 7 0.22 4 2 0.00 8 1 0.21 9 1 0.19 1 3 0.30 6 8 0.20 7 3 0.21 1 4 0.00-0.143 9 0.292 4 0.143 9 0.144 8 0.145 3 0.269 7 0.274 4 0.274 3 0.002 7 0.144 5 0.284 9 0.304 0 0.310 0 0.287 4 0.294 4 0.144 6 0.235 2 0.145 5 0.233 7 0.207 6 0.316 7 0.213 2 0.224 9 0.144 2 aguobai g Pulankeb glinhong ai on angguohong Jilongjipu a白Xiayadong Mangkang Ch Pulankeh glinbai mahong ai白Laduo Qion Qingshu 9 Longziqieb巴Ch ayu东Milin红ilong Yadong Em红Gongbu Ch普Jidexiu Saibangb Qion gdu entanghong mabai白Ch an科Du Em ozha科红吉秀白红L u 9号切红Juela Ch白果多康林隅兰亚林兰龙东玛布果隆德帮林扎薯子塘拉都玛查拉芒琼察普下米普堆亚艾工昌吉吉赛琼洛青隆陈觉昌艾)between varieties.etic distance(DR DR）。er triangle is the gen（离距传st),and the upp遗(F间种品为角三上Fst），ifferentiation coefficient（数系化分传遗间种品为三he lower triangle is the genetic d角注Note:T下：

由图1可知，可将25个马铃薯品种划分为3个类群。第Ⅰ类群和第Ⅱ类群各包括10个马铃薯品种，第Ⅲ类群包括5个马铃薯品种。西藏自治区当地主栽品种‘艾玛白’与‘查果白’、‘堆龙’、‘洛扎’、‘亚东’、‘察隅’、‘琼林白’、‘拉多’、‘赛帮白’、‘普兰科白’聚集到第Ⅰ类群，‘青薯9号’与‘昌果红’、‘觉拉’、‘隆子切巴’、‘工布’、‘艾玛红’、‘芒康’、‘普兰科红’、‘昌都’、‘下亚东’聚集到第Ⅱ类类群，‘陈塘红’、‘琼林红’、‘吉德秀’、‘吉隆吉普’和‘米林’聚集到第Ⅲ类群。每一类群都有不同地理来源的马铃薯品种，同一地理来源的地方品种分散聚集于不同类群，表明类群聚集与地理来源无明显相关性。

2.5 主成分分析

主成分分析是基于个体基因组SNP 差异程度，按照不同性状特征将个体按主成分进行聚类成不同的亚群，同时与其他聚类方法的结果相互验证。由图2可知，‘查果白’和‘堆龙’聚集，与第Ⅰ类群的其他品种相距较近，第Ⅰ类群的10个品种首先与其他品种分开；第Ⅱ类群中的品种间相距较远，‘普兰科红’、‘隆子切巴’和‘觉拉’聚集，与其他品种相距较远；第Ⅲ类群中的5个品种比较分散，‘米林’和‘基隆吉普’与第Ⅱ类群的多数品种相距较近，‘陈塘红’与所有参试品种距离较远。由此可看出，这与系统进化树的分类结果基本一致。

3 讨 论

马铃薯遗传多样性分析研究方法以Amplified fragment length polymorphism（AFLP）、Simple sequence repeats（SSR）、Random amplifiedpolymorphic DNA（RAPD）和Inter-simple sequence repeat（ISSR）标记较为多见。这些分子标记方法技术成熟，支持文献丰富，但存在试验过程繁琐、所选标记在基因组中的覆盖度低等不足[9]。GBS技术相比传统分析方法，选用的遗传标记数量多，能够覆盖全基因组，可全面、准确地揭示研究物种的遗传特征。目前该方法已在柑橘[10]、烟草[11]、玉米[12]、托氏琩螺[9]等物种进行了群体多样性分析，具有更高的准确性和稳定性。本研究通过GBS技术对125个马铃薯样本进行测序，产生的高质量序列数据量为130.22 Gb，共获得93 435个高质量的SNP位点用于后续遗传多样性分析。

遗传多样性是生物遗传物质DNA 的多样性，生物遗传多样性越高，包含的基因就越丰富，该物种的抗病性、抗逆性及对环境变化的适应能力就越强[13]。众多研究发现，中国马铃薯品种都不同程度存在亲缘关系较近和遗传多样性不足的情况。李建武等[6]利用11对SSR引物对42份甘肃省主栽的马铃薯品种进行了遗传多样性分析，结果表明甘肃省主栽马铃薯品种之间的遗传相似性较高，遗传基础较狭窄；滕长才等[7]利用30对SSR引物对12份青海省马铃薯主栽品种进行了遗传多样性分析，认为遗传多样性水平较低；赵光磊等[8]利用20 对SRAP 引物对34 份黑龙江马铃薯主栽品种遗传多样性进行分析，显示遗传相似性较高，遗传多样性程度较低。

等位基因数（N）、杂合度（H）是评估遗传多样性的主要指标，值越高，说明其受到的选择压力越小，其遗传多样性越丰富[14]。Ghislain 等[15]通过将PIC 数值划分为 3 个区间 PIC ＞ 0.5，0.25 ＜ PIC ＜ 0.5和PIC ＜0.25 来对应引物多态性程度的高、中和低，以此来衡量基因变异程度的高低。刘易科等[16]利用SNP芯片技术分析小麦品种的遗传多样性，结果表明，PIC 值的变幅为0.01～0.38，平均值为0.26，育成的品种遗传基础不够丰富，蔡露等[11]利用GBS 技术对92 份烟草种质资源进行遗传多样分析，Na 为 1.27～1.93，Ho 为 0.22～0.76，He 为 0.32～0.59，整体遗传多样性偏低。本研究中供试马铃薯品种的 Ho 为 0.24，He 为 0.19，Ne 为 1.29，PIC 为0.16，PI 为0.19，均表现较低，表明参试品种的遗传多样性较低。

西藏自治区地域广阔，东西跨度大，边境线长，马铃薯地方品种间应更易产生遗传分化，但随着交通的便利，各地品种间的交流越来越频繁，从而导致部分品种资源的浪费及遗传分化的较少。Wright[17]提出，遗传分化指数 Fst 介于 0～0.05 的种群遗传分化很小，0.05～0.15 的种群遗传分化中等，0.15～0.25 的种群遗传分化很大，大于0.25 表明种群遗传分化极大。本研究中10 个马铃薯品种的Fst值大于0.25，与其他参试品种有很大的遗传分化，遗传距离大，遗传背景差异较大，亲缘关系较远。平均值较小的8个品种间Fst值小于0.05，遗传分化很小，遗传距离短。本研究中25 个马铃薯品种的遗传分化水平整体较高，遗传距离较远，但部分品种间的遗传分化很低，遗传距离近，可能与地方品种间的交流有关。

基于遗传分化系数、进化树和主成分分析，25个马铃薯品种划分为3个类群。第Ⅰ类群中品种间遗传分化较小，遗传距离较近，亲缘关系较近；第Ⅱ类群中的品种遗传分化较大，遗传距离较远；第Ⅲ类群中的品种遗传分化很大，遗传距离远，每个品种单独聚集，亲缘关系较远；且类群聚集与地理来源无明显相关性。系统进化树中部分品种的5株并没有聚合在一起，表明5个样品间存在差异，这与地方品种的混乱有关，5个样品的表型性状相同或相似，但在基因层面却存在一定差异，地方品种间存在同名异物与同物异名的现象。

综上所述，西藏自治区马铃薯地方品种遗传多样性较低，部分品种间亲缘关系较近。本研究结果有助于了解西藏自治区马铃薯地方品种的遗传多样性水平，为丰富马铃薯种质资源，利用及保护马铃薯地方品种提供依据。