循环肿瘤细胞形态学分析在老年非小细胞肺癌患者中的应用及其与预后相关的分析

武韫，吕帆真，吴越，牛玉旭，高文

复旦大学附属华东医院胸外科，上海200040

肺癌是全球发病率及死亡率最高的恶性肿瘤，近年来，肺癌在我国发病率快速增长，达到26.9%，已是我国发病率及死亡率最高的恶性肿瘤[1]。随着患病人数的增加，老年患者患病的比例也逐渐增多，此类患者具有一般情况差，合并症多，无法耐受放化疗等特点，因此预后往往不良[2]。近年来，随着以靶向治疗与免疫药物的广泛推广应用，肺癌患者的生存率有所提高，但由于肿瘤异质性的存在，大部分患者在用药后会出现耐药。如何在影像学进展前有效地判断疾病进展，从而给予提前干预，是老年非小细胞肺癌患者亟需解决问题。近年来，液体活检在肺癌诊疗过程中广泛应用[3]，其中，循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）检测其具有检测方便，检测过程中创伤小，且具有可重复检测的优点。是目前肿瘤诊断治疗中的研究热点。本研究拟将CTC 形态学分析应用于老年非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者的预后判断，拟为老年NSCLC 患者的诊疗提供新的依据。

1 资料和方法

1.1 研究对象 本研究回顾性分析了2017年1月-2019年12月在复旦大学附属华东医院接受肺癌手术的312例老年患者，入选标准为：（1）病理证实的原发性非小细胞肺癌，一般基线资料完整；（2）年龄≥70 岁；（3）术前CTC 检测阳性；（4）术中能够获取肺癌组织及对照癌旁组织，所获取标本能即刻进行液氮（-80°C）储存；排除标准为：（1）临床随访资料不完整；（2）术前未能检测到CTC；（3）既往恶性肿瘤病史、严重感染、肝功能不全、出凝血功能障碍的患者。

1.2 病例数据收集及随访 术后收集数据包含一般基线资料，具体包括：性别、年龄、病理分级、TNM 分级（IASLC 第7 版）[4]等。以OS 与DFS 评估患者的术后生存状况。术后2年患者，每3月随访胸部CT、B 超、肿瘤标志物，每半年随访骨扫描及头颅MRI；术后第3年病例，每半年随访以上胸部CT、B 超、肿瘤标志物，每年随访骨扫描及头颅MRI。

1.3 CTC 捕获及形态学分析 人外周血CTC 检测、富集试剂盒购买自上海顿慧医疗科技有限公司。CTC 检测及富集参考文献[5]。利用抗凝管采集术前患者静脉血5 mL, 混匀，血浆分离、红细胞裂解、白细胞分离、涂片自然干燥、免疫荧光染色。CTC 判定标准为：DAPI (+)，EPCAM/CK (+)，CD45 (-)；将分离的CTC细胞利用图像综合处理系统，测量所获得CTC细胞直径，根据细胞直径数值的中位数，将所捕获CTC 分为大细胞型CTC (large size CTC L-CTC) 组和小细胞型CTC (small size CTC；S-CTC) 组；

1.4 统计学分析 应用SPSS 22.0 统计软件进行数据处理。计量资料采用中位数或4 分位数间距表示，组间比较采用 检验, 技术资料采用或Fisher's 精确检验；不符正态分布的数据采用用Mann-Whittle 检验。Kaplan-Meier 法计算总生存率(OS) 及预后价值判断采用log-rank 对数秩和检验, Cox 比例风险模型进行多因素生存分析；＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

本研究共纳入患者108 例，中位随访时间为22个月。年龄范围70～81 岁，平均年龄（73.8±3.7）岁，其中女性59 例，男性59 例。具吸烟或吸烟史患者26例。基于TNM 分级将患者进行分期，其中I 期患者12 例，II 期患者39 例，III 期患者39 例，IV 期患者18 例；中位CTC 数为4 个，利用图像处理系统, 将获得的CTC 根据细胞直径数值的中位数（(6m)）分为大细胞为主型CTC（L-CTC）与小细胞为主型CTC（S-CTC）。其中大细胞为主型CTC 患者共52 例，小细胞CTC 为主型患者共56 例。见表1。

表1 2 组108 例CTC 患者的临床病理资料

全组患者无围术期死亡病例。截止随访终点，死亡38 例，全组OS 为64.8%，DFS 为54.6%；其中LCTC 组死亡15 例，中位生存期为29.3 个月，OS 为71.5%, DFS 为57.69%；S-CTC 组死亡23 例, 中位生存期为20.8 个月，OS 为58.92%；DFS 为51.78%，L-CTC 组OS 及DFS 高于S-CTC 组（＜0.05）（见图1）以Cox 法单因素及多因素分析影响该组患者的预后因素，结果提示：TNM 分期、淋巴结累及以及小细胞型CTC 是影响本组患者预后的因素。见表2。

3 讨论

表2 影响老年非小细胞肺癌预后的因素

近年来，肺癌是我国发病率及死亡率最高的恶性肿瘤。随着发病率的上升，老年肺癌患者逐年增多，如何对这些耐受性较差的患者进行术前病情的精准评估、术后复发转移的早期发现，耐药后早期干预，以提高治疗效果，是目前亟需解决的问题。CTC 检测因其无创性、可重复性已广泛应用于肺癌的诊疗。然而检索文献，现阶段的应用局限于单纯计数，无法区分捕获CTC 是否具有侵袭性，因此限制了该方法的临床应用[6]。本研究在捕获CTC 的基础上，利用图像分析系统，探索性的根据捕获CTC 直径大小，对捕获CTC 进行分类，将CTC 分为大细胞CTC 和小细胞CTC，并结合临床相关数据，发现小细胞型CTC在进展期疾病及淋巴结转移的患者中较多，且与疾病的不良预后有关。通过本研究的开展，可判断捕获CTC 的侵袭性，部分解决肿瘤异质性的特点。

循环肿瘤细胞通常是指从原发灶或转移灶侵入人体外周血的肿瘤细胞。CTCs 一般以单细胞或者细胞团的形式存在于循环系统中。大部分侵入循环系统的肿瘤细胞会在短期内被机体免疫系统识别并清除，少数细胞通过肿瘤微环境的改变逃过免疫监视，发展为具有侵袭性的CTCs，并相互聚集成团，进而形成CTC簇，并在一定条件下成为转移灶[7]。因此在外周血中检测到循环肿瘤细胞常预示着将有可能发生肿瘤进展。国内外多项研究报道，CTCs 可作为肺癌疗效评价及预后、检测转移及复发的重要指标，也可检测肺癌驱动基因的状态，指导肺癌的靶向治疗[8-10]。近年来虽然CTCs 检测技术不断发展，但由于富集和检测方法不同，临床上CTCs 的应用仍局限于简单的计数，不能区分CTC 是否具活性，因此在指导临床诊疗时可能会出现偏差；因此除了对CTCs 进行计数以外，如何在肺癌患者中筛选具有侵袭性的CTC，并在此基础上分析及细胞表型及分子表型，是本研究的重点。本研究发现，在肺癌患者中，小细胞型CTC 在发生远处转移（15/18）及淋巴结累及的患者中较多（46/69），可见在老年患者中，小细胞型CTC 患者更容易发生远处转移。因此针对此类患者，术前出现小细胞型CTC，术中是否应行淋巴结采样或系统性淋巴结清，术后是否需要加强治疗仍需下阶段的临床研究证实。

目前认为，CTCs 从肿瘤的原发灶、转移灶或者累及的淋巴结突破血管基底膜进入外周血，在此过程中发生上皮间质转化（EMT）或间充质移动方式向阿米巴样移动方式的转变过程（MAT）[11]，绝大多数CTCs 在此阶段被宿主免疫系统所清除，少部分细胞在逃脱免疫监视，发生免疫逃逸后，相互聚集成团，依附于外周血中的宿主细胞（主要白细胞、血小板），经血流传播至远处器官（骨、脑、肺或肝等常见的肺癌转移部位），经种植生长发展为远处转移灶，由CTCs转变的转移肿瘤细胞（disseminated tumor cells，DTCs）重复以上过程，将新的CTCs 释放入血，形成新的远处转移灶[12]。在此过程中，CTCs 的形态学发挥重要的作用，Dong 等[13]的研究认为，小细胞型CTC 较大细胞型CTC，能更有效的逃脱免疫监视，发生免疫逃逸，从而形成远处转移灶。Loredana 等在乳腺癌裸鼠模型中发现，sCTC 更容易形成CTC 簇，且周围有较多血小板粘附，能够改变肿瘤微环境进行远处转移。但以上研究均未能从分子机制上进行探索，亦未能得出特异性的分子标志物。本研究尝试将CTC 分型与临床病理进行关联分析，发现CTC 分型与病理类型无关，只与疾病进展有关。这一现象提示，对于CTC形态学在肺癌中的应用，现阶段仍应聚焦于动态监测，以作为临床诊疗证据的补充。在疾病发生进展时，是否存在CTC 形态学的转换，CTC 形态学的改变能否作为药物干预的依据，在老年肺癌患者中所获得的CTC 形态学结论是否能推广到所有患者中，这些都是后续工作中需要解决的问题。

综上所述，本研究发现CTC 形态学分析能够较好的预测肺癌的预后及进展，小细胞型CTC 与肺癌的进展有关，且是老年NSCLC 预后的不良因素，但其影响肺癌发生发展的具体机制，仍需进一步探索。