尿酸酶-过氧化物酶偶联反应检测血清尿酸过程中的干扰分析

周晓娜，方宏罡，曹艳菲，李新娜，张丽娜，陆怡德

（1.大庆油田总医院检验科，黑龙江 大庆 161000；2.上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科，上海 200025）

尿酸（uric acid，UA）是嘌呤化合物代谢的终末产物，高UA 血症与痛风、肾脏疾病、代谢综合征、心血管疾病的发生及发展密切相关。近年来随着研究的深入，UA 被视为某些疾病病理过程中重要的参与分子，其可直接影响免疫应答，抑制炎性小体的激活及炎症的发生[1-4]。因此，准确检测血清UA水平对于临床诊治具有重要的参考价值。目前实验室常用的检测方法为尿酸酶-过氧化物酶偶联反应、磷钨酸还原法等。本研究对临床工作中发现的2 个血清UA 检测异常低值的病例进行探讨，分析可能干扰测定结果的因素，并进行一系列试验证明，找到了消除干扰的方法，现报告如下。

资料与方法

一、资料

病例1 为男性，36 岁，在无明显诱因下出现左下肢酸痛，血常规提示白细胞 （white blood cell,WBC）计数225.6×109/L，血红蛋白（hemoglobin,Hb）112 g/L，血小板（platelet,PLT）计数108×109/L，原始幼稚细胞0.66。患者行骨髓穿刺检查提示为急性淋巴细胞白血病L2型，骨髓流式细胞术检查提示HLADR(+)、CD10(+)、CD19(+)、CD22(+)、CD34(+)、CD79a(+)，以急性淋巴细胞白血病收治入院。入院后予患者VDPCP 方案（培门冬酶、长春新碱、依达比星、环磷酰胺、甲泼尼龙）化疗，同时予以碱化、水化及拉布立酶治疗。患者血清UA 检测值为18.2 μmol/L，检测仪器出现异常报警（G 旗标）。

病例2 为女性，68 岁，在无明显诱因下出现头晕、胸闷不适，入院诊断为高血压病3 级（极高危）、急性冠状动脉综合征,服用拜新同（硝苯地平控释片）、氯沙坦钾、氢氯噻嗪治疗。患者有牙龈出血、鼻腔出血等症状，请血液科会诊后拟诊为巨球蛋白血症，建议复查免疫球蛋白。血常规检测结果提示，WBC 计数3.41×109/L，红细胞计数2.79×1012/L，Hb 87 g/L，PLT 计数143×109/L，总蛋白125 g/L，白蛋白27 g/L，IgG 10.6 g/L，IgA 3.96 g/L，IgM 88.3 g/L（↑）；血清免疫固定电泳示IgM κ 型M 蛋白强阳性；骨髓切片显示骨髓增生活跃，粒细胞红细胞比例降低，淋巴细胞比例升高，部分淋巴细胞可见浆细胞样分化，成熟红细胞呈缗钱状排列。患者的血清UA 检测值为-49 μmol/L，仪器出现异常报警（G 旗标）。

二、方法

1.仪器与试剂：采集患者当天清晨空腹静脉血3 mL，置于分离胶促凝管中，充分混匀，以3 500 r/min离心5 min（离心半径为11.5 cm），分离血清后上机进行检测。采用尿酸酶-过氧化物酶偶联反应测定血清UA 水平，所用试剂为原装贝克曼-库尔特尿酸试剂盒（批号AUZ5250）及配套高值、低值质控品（批号分别为M806001、M806003），检测仪器为贝克曼-库尔特AU5800 全自动生化分析仪，检测过程严格遵循实验室制定的质量控制程序。

2.干扰的纠正：①稀释法测定,用蒸馏水2 倍、5 倍稀释样本后测定UA 结果，观察稀释后反应曲线是否正常；②聚乙二醇PEG6000 蛋白沉淀法[4]测定,取9 份免疫球蛋白正常的样本和病例样本，用配制的250 g/L PEG6000 溶液对10 份标本按1∶1稀释，涡旋振荡30 s，室温放置15 min，以10 000×g离心5 min，取上清液检测UA，测定结果乘以2，观察反应曲线是否正常。

结 果

一、干扰的发现

病例1 的血清UA 测定结果为18.2 μmol/L，仪器出现报警（G 旗标）。将反应曲线与高值、低值质控血清比较（见图1），可见其反应曲线与正常低值反应曲线不同，加入试剂2（Reagent 2，R2）后，吸光度值仅有轻微上升，考虑吸样错误或血清UA 真性降低。将病例1 血清吸到样本杯中重新上机测定，结果为负值，排除吸样错误可能。将病例1 血清与正常血清按1∶1 混合后，分别于1 h、2 h 后测定3 次，检测结果见表1，提示随着时间的推移，UA 检测结果逐渐减低，推测血清中含有可分解UA 的物质。

病例2 的血清UA 检测结果为负值，仪器出现报警（G 旗标），将反应曲线与高值、低值质控血清比较（见图2），可见其曲线与正常低值反应曲线不同，血清与UA 试剂1（Reagent 1，R1）混合后，基线吸光度值迅速升高。按照试剂说明书中的参数，将样本和试剂量增加到10 倍，进行手工反应，病例2 的血清加入UA 试剂R1 便产生了肉眼可见的白色絮状沉淀，离心后取沉淀物，将该沉淀加热到37 ℃和冷却到4 ℃均保持稳定，推测病例2 血清中含有异常蛋白成分。

表1 病例1 血清UA 随时间变化的测定值（μmol/L）

图2 尿酸酶-过氧化物酶偶联反应测定UA 反应曲线

二、干扰的纠正

根据病例1 的病史及拉布立酶的使用说明，对病例1 重新进行血液采集后置于预先冷藏的肝素抗凝管中，迅速离心后上机测定，结果显示，测得的血清UA 水平为102.0 μmol/L，反应曲线正常，干扰被纠正。

病例2 采用稀释法测定结果分别为-30.9 μmol/L和-42.2 μmol/L，稀释后反应曲线仍为异常；采用聚乙二醇PEG6000 蛋白沉淀法，取上清液检测血清UA 水平，测定结果为158.5 μmol/L，反应曲线正常，且9 份标本回收率为94.8%、97.6%、95.4%、97.3%、98.1%、102.6%、99.5%、98.7%、96.4%。

图3 病例2 血清加入UA 试剂R1 后的沉淀

讨 论

中华医学会风湿病学分会在2011 年制定并推出了原发性痛风诊断和治疗指南，表明临床对血清UA 水平关注度越来越高，而血清UA 检测结果的正确与否，直接关系到患者的诊治[5]。

一、外源性药物干扰

例1 患者为急性淋巴细胞白血病L2型，而初治的血液肿瘤患者最易发生肿瘤溶解综合征（tumor lysis syndrome，TLS）中，尤其是急性B 淋巴细胞白血病及Burkitt 淋巴瘤。TLS 是由恶性肿瘤细胞自发的或者在药物作用下大量、快速溶解后细胞内容物释放入血产生的一组代谢紊乱症状，临床特点为血UA、血钾、血尿素氮升高及低钙血症，严重时可出现肾功能不全、心律失常及抽搐[6]。

拉布立酶是一种重组尿酸氧化酶，用于治疗和预防血液恶性肿瘤患者在化疗初期其肿瘤迅速溶解、萎缩导致的急性高UA 血症，防止急性肾功能衰竭的发生。其降UA 作用是将溶解度相对较低的UA 转换为更易溶解的尿囊素，与尿酸酶-过氧化物酶偶联反应测定UA 方法的第一步反应完全相同。这也就是病例1 血清UA 值在体外环境中持续下降的原因，表现为与正常患者血清混合后，混合血清UA 值仍持续下降。为避免拉布立酶在室温下发生酶促反应降解UA，拉布立酶的使用说明中指出临床上应用拉布立酶的患者测定UA 时，应将血液采集至预先冷藏的肝素抗凝管，并立即浸入冰水浴中，在预冷离心机（4 ℃）中制备血浆，血浆必须保存在冰水浴中，并在4 h 内完成检测，才能获得准确的检测结果。

除拉布立酶外，有文献报道酚磺乙胺[6]、羟苯磺酸钙[7]等多种药物也可以干扰尿酸酶-过氧化物酶偶联反应测定血清UA 结果。事实上，近年来人们已经充分认识到多种外源性药物对生化检测项目测定的影响，这可以根据美国临床与实验室标准化研究所推荐的EP7-A2[8]干扰实验程序，设计配对差异实验和剂量实验，分析药物对检测结果的干扰以及干扰物水平与干扰程度之间的关系，这些将在后续的研究中进一步探讨。

二、内源性蛋白干扰

M 蛋白是浆细胞或B 淋巴细胞单克隆恶性增殖所产生的一种在氨基酸组成及顺序上十分均一的异常免疫球蛋白，可以是IgG、IgM、IgA、IgE、IgD或κ、λ 中的任何一型。由于M 蛋白自身独特的物理、化学及免疫学特性，在特定条件下产生沉淀可干扰比色和浊度分析，或与分析体系中的组分特异性或非特异性结合，引起假性结果。近年来，已有多篇文献报道了M 蛋白在不同检测项目、不同类型标本以及不同检测方法中存在干扰检测结果的现象[9-10]。

病例2 患者的血清UA 检测结果为负值，可能是由于血清中的M 蛋白与UA 试剂R1 中的磷酸盐缓冲液混合后恰好达到了此类M 蛋白的等电点而产生了沉淀。同时，由于贝克曼-库尔特AU5800全自动生化分析仪使用的试剂为浓缩试剂，反应的过程中需加入去离子水预稀释，改变了试剂的缓冲体系、离子强度等，使其溶解度下降，更易析出蛋白质而形成沉淀，导致血清与试剂R1 混合后基线吸光度值迅速升高，使仪器计算得到的最终结果为负值。在日常工作中，M 蛋白的干扰通常采用稀释法、超滤法以及蛋白沉淀法纠正[11]，但目前尚没有统一的方法能够完全消除此类干扰，不同的M 蛋白类型及浓度、不同的检测项目、不同的实验方法采用的纠正方法也不一致。本研究中稀释法无法纠正病例2 血清中M 蛋白的干扰，稀释后反应曲线仍然异常，需要采用蛋白沉淀法才能纠正，标本回收率为94.8%～102.6%。消除这样的干扰，一方面需要仪器、试剂厂家改进检测方法，调节试剂的pH 值和离子强度，防止蛋白沉淀或是在试剂中添加表面活性剂等促进蛋白溶解[12-13]；另一方面需要检验工作者在实际工作中要注意仪器上的异常报警，及时分析存在的干扰因素。必要时可采用推荐方法测定，尽可能减少M 蛋白对UA 检测的干扰，为临床提供准确的检验结果。

M 蛋白的存在干扰了正常的检测，很多单克隆免疫球蛋白血症的患者发病缓慢、隐匿，临床表现多种多样，疾病早期常被误诊、漏诊。因此，当发现异常的血清UA 检测结果时，结合其特殊的反应曲线进行分析，可提示M 蛋白存在的可能，为临床提供更丰富的信息提示。