小鼠生物法与ELISA法对腹泻性贝类毒素的检测比较

杜伟，张晓辉，孔蕾，王鼎南，郑重莺*

(1.浙江省海洋监测预报中心，浙江 杭州 310007； 2.浙江省海洋科学院，浙江 杭州 310010； 3.浙江省水产技术推广总站，浙江 杭州 310023)

赤潮(red tides，国际上也称有害藻华harmful algal blooms)是指在一定环境条件下，海洋生物(以单细胞藻类为主)迅速增殖或积聚而产生的一种海水变色的自然现象[1]。赤潮发生时，区域海洋生态系统失衡，赤潮优势种优势度明显，群落中海洋生物多样性明显降低；在赤潮消亡期，大量赤潮生物降解过程在短时间内急剧消耗所在海域中的氧气，造成异养生物因缺氧而死亡，进而对区域海洋环境和生物、海洋渔业资源、水产养殖业及滨海旅游业等产生不利影响，如引发赤潮的海洋生物为有毒赤潮藻，其产生的贝类毒素通过食物链不仅影响区域海洋生态系统的结构、功能和稳定性，还有可能威胁海洋食品安全，人类误食含有贝类毒素(赤潮藻毒素)的食品时可能中毒，严重者有死亡风险。近些年全球赤潮一直处于高发状态，而我国近岸海域赤潮也处于高发状态，且近年时有人类误食含赤潮藻毒素的贝类而发生中毒或疑似中毒的报道[2-4]。

腹泻性贝类毒素(diarrhetic shellfish poisoning，DSP)是在世界范围内广布并引起人类中毒较多的一类赤潮藻毒素[5]，具有相对热稳定性，日常方式加热很难使其降解或使毒性减小，且该毒素在贝类肌肉和内脏中分布情况没有明显差异，很难通过去除内脏等方式减少食用DSP引起中毒的概率。它是一类聚醚类或大环内酯类化合物，脂溶性，其结构复杂，化学性质稳定，能够在贝类等海洋生物体内积累(富集)、降解，甚至有些毒素可在贝类体内进行转化[6]。根据结构特征，一般将常见DSP分为3大类，其中常引起人类中毒的种类为酸性成分的大田软海绵酸(okadaic acid，OA)及其天然衍生物鳍藻毒素(dinophysistoxins，DTX 1～3)，而中性成分的扇贝毒素(pectenotoxins，PTXs)、其他成分的虾夷扇贝毒素(yessotoxins，YTXs)及45-羟基扇贝毒素则比较少见。可产生腹泻性贝类毒素的有毒赤潮藻主要为海洋甲藻，如鳍藻(Dinophysisspp.)、原甲藻(Prorocentrumspp.)等[7]。

作为生物毒素，DSP的致毒机理比较复杂，一般认为其活性成分软海绵酸可抑制哺乳动物血液细胞质中的蛋白质磷酸酶的活性，导致蛋白质去磷酸化过程受到抑制，进而影响消化道、肝脏等器官功能，最直观的表现有恶心、呕吐、腹泻等[8]。小鼠试验表明，DSP对其毒性可作用于肝脏、心肌等器官，同时还具有致畸、致突变作用[9]。另外，DSP对人和动物的致毒影响可能有叠加效应，多次低浓度、亚慢性中毒可能会增加其对中毒者健康的危害。

随着检测技术的进步，开发出多种对DSP的检测方法，包括小鼠生物法、色谱法、色谱质谱联用法、电泳法、免疫学检测技术、细胞毒性检测技术等，其中免疫学检测技术在实践中常用的为酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，《食品安全国家标准 贝类中腹泻性贝类毒素的测定》(GB 5009.212-2016)中增加了酶联免疫吸附法作为食品国家标准方法[10]。本文比较了小鼠生物法与ELISA法检测样品中DSP含量的差异，旨在为一线检测人员测定水产品中DSP含量提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用竹蛏、紫贻贝、厚壳贻贝、蛤蜊购自浙江省水产码头海鲜市场。试验用小鼠为ICR系雄性小鼠，体重18～20 g；腹泻性贝类毒素检测试剂盒(品牌为ABRAXIS)；腹泻性贝类毒素标准品OA(软海绵酸，纯度99.5%，加拿大国家研究院海洋研究所)。其他试验用试剂均为分析纯，试验用水为去离子水。

试验设备与量器。酶标仪，精度为0.01 g的电子天平，机械秒表及其他实验室常用仪器设备与量器等，所有需要计量的设备和量器均在有效期内。

1.2 样品处理与制备

取购自水产市场的竹蛏、紫贻贝、厚壳贻贝及蛤蜊，用自来水充分洗净贝类外壳，打开外壳，用自来水淋洗贝类外壳内部以去除泥沙及其他外来杂质，用镊子取出贝肉，用去离子水洗净取出的贝肉，然后沥水10 min，挑拣出贝肉中碎壳等杂物，用均质器将贝肉均质备用。

竹蛏加标样品处理。分别取往年实验室检测任务中竹蛏DSP阴性样品10份，每份500 g，将贝肉座均质化处理，1份作为阴性控制样，其余9份阴性样品分别加入配制好的DSP含量为175.00、150.00、125.00、100.00、50.00、25.00、10.00、5.00、4.00 μg的标准溶液，震荡1 min，制成竹蛏加标样1～9。

1.3 小鼠生物测定法

从已均质好的贝类样品中提取DSP和小鼠生物法试验参照GB 5009.212—2016《食品安全国家标准 贝类中腹泻性贝类毒素的测定》第一法 小鼠生物法执行[10]，所有样品做平行样。小鼠生物法检测DSP含量检出限为50 MU·kg-1。

1.4 ELISA法测定

取1.00 g均质后的竹蛏、紫贻贝、厚壳贻贝、蛤蜊、竹蛏阴性样品或竹蛏加标样品于干净离心管中，加入甲醇溶液(V∶V为8∶2)10 mL，充分振荡，将混合液于4 000 r·min-1离心10 min，取上清液200 μL，用样品稀释缓冲液稀释到2.0 mL，振荡1 min；取上步骤样品溶液100 μL，待测。所有样品做平行样测定。

按照试剂盒自带的说明书操作ELISA法检测程序，根据本试验样品提取、提取液稀释倍数及试剂盒本身的最低检出限值，确定本试验ELISA法检测DSP的检出限为10 μg·kg-1，满足GB 5009.212—2016第二法 酶联免疫吸附法的规定[10]。

1.5 定量计算

试验结果按GB 5009.212—2016[10]中规定的计算方法定量计算，其中小鼠生物法计算结果值(MU·kg-1)、ELISA法计算结果值(μg·kg-1)。本试验对于OA的检测结果等同于对DSP的检测结果。根据西太平洋地区DSP毒力经验值，按照1 MU(OA)=4 μg(OA)将小鼠生物法检测结果单位进行换算成μg·kg-1。

平行样的处理方式。检测结果均为阳性时，DSP含量取算数平均值；检测结果均为阴性时，DSP含量报未检出；平行样中1个检测结果为阳性、1个结果为阴性，则阴性检测结果按照检出限的1/2参加计算，即样品中DSP含量检测结果为阳性样品结果值和检出限1/2值的算数平均值。

加标样检测结果和加标回收率修约规则。检测结果按照“四舍六入五留双”规则修约至整数，加标回收率按照“四舍六入五留双”规则保留3位有效数字。

在园林景观的设计中，园林植物配置应与周边环境氛围相结合，例如，学校的景观设计，应根据学校的环境，选择桃树和李树作为主要树种，如紫叶李、桃树等，以颂扬教师默默耕耘、无私奉献的精神；政府机关的设计应根据政府机关的环境景观特点，选择荷花和竹子作为主要树种，以表达公务员出淤泥而不染、全心全意为人们服务的精神；居住区的景观设计应根据居住区的环境景观特色，选择柏树和梧桐树作为主要树种，以代表人们的高洁庄严、长寿无疆的寓意。

2 结果与分析

由表1可知，ELISA法和小鼠生物法均可用于对贝类样品中DSP含量进行检测。

采用小鼠法检测，试验中竹蛏、紫贻贝、厚壳贻贝、蛤蜊、竹蛏阴性等样品，以及竹蛏加标样品4～9等样品检测结果为阴性，即没有检出样品中含有DSP；试验中竹蛏加标样品1检测结果为阳性；试验中竹蛏加标样品2和3，其均有1个平行样检测结果为阴性，相对应的平行样检测结果为阳性，按照本试验对于平行样检测结果的处理方式，竹蛏加标样品2和3的检测结果为阴性。

表1 不同检测方法对DSP含量的影响

采用ELISA法检测，试验中竹蛏加标样品1～8检测结果为阳性，其他样品检测结果均为未检出，加标样品1～8的检测结果加标回收率为84.0%～100%，满足实验室ELISA法加标回收率(70.0%～120%)的要求。

根据试验结果，检测贝类样品中DSP含量时，样品中DSP含量在300 μg·kg-1以上时，2种检测方法均为阳性，但2种检测方法结果有差异；样品中DSP含量在200～300 μg·kg-1时，ELISA法可准确检测样品中DSP含量，而小鼠生物法可出现假阴性反应；样品中DSP含量在10～200 μg·kg-1时，利用小鼠生物法无法检测样品中DSP含量，而ELISA法可准确检测样品中DSP；在DSP阴性样品中两者检测结果一致。

综上，对于阴性样品及DSP加标量在10 μg·kg-1以下的贝类样品，小鼠生物法和ELISA法检测结果均为阴性。对于DSP加标量在10～200 μg·kg-1的竹蛏加标样品，小鼠生物法无法检测到样品中的DSP，而ELISA法检测结果为阳性，且其检测值以加标回收率计算，满足试验要求。

3 小结与讨论

本试验主要对小鼠生物法和ELISA法检测贝类中DSP含量做了比较研究，试验结果表明,贝类中DSP含量处于不同浓度水平时，两种检测方法的检测存在差异。

贝类中DSP含量在10～200 μg·kg-1时，ELISA法可以准确检测贝类中DSP含量，而小鼠生物法的检测结果为未检出，这跟小鼠生物法的检出限(0.05 MU·g-1，等同于200 μg·kg-1)偏高有关，说明小鼠生物法无法检测到低浓度水平的DSP。

贝类中DSP含量在10 μg·kg-1以下时，两种检测方法的检测结果一致。

正常情况下，在方法检出限以上，通过对贝类样品提取液进行合适倍数稀释，利用ELISA法和小鼠生物法对贝类样品DSP含量检测时能得到吻合度较好的结果；但从检测方法原理上分析，小鼠生物法检测结果会略高于ELISA法检测结果。究其原因，在提取充分前提下，利用小鼠生物法检测毒性试验的结果值包含了样品中DSP含量的总和，而现在市售贝类毒素ELISA法检测试剂盒利用的原理是抗体-抗原反应，而用于微孔板包被或后期试验中添加的DSP抗体均为单抗。比如本次试验中使用的ELISA检测试剂盒，包被在微孔板上的二抗及试验中添加的一抗均为单抗，其相对抗原主要为DSP中的OA、DTX-1、DTX-2等，而对其他组分的DSP交叉反应率较小。

本试验出现小鼠生物法检测结果比ELISA法较低现象，这虽然和两种检测方法原理的对比分析相悖，但在现实试验中可能较为常见。作为传统检测方法，小鼠生物法以检测步骤操作简单和可检测样品中DSP总量一直被用作检测DSP含量的首选方法，但实际检测过程中，因有机溶剂提取阶段很难保证DSP被完全提取、减压蒸馏浓缩阶段存在DSP随有机溶剂挥发的可能，往往会使检测结果偏低，甚至出现假阴性。小鼠生物法所用样品量较大，一般为200 g，这使得其在样品量较小时很难用于检测。

经过多年发展，ELISA法已经被很好应用到检测贝类中DSP含量试验，而且该方法在2016年首次被写进国家食品检测标准中，依靠其较低检出限、较高灵敏度、较快检测速度逐渐被广大一线检测人员所接受，由于需要专门检测设备和较高检测试剂盒价格，其推广度受到影响。具体到实际试验中，在需要检测大批量贝类样品时，可以考虑先用ELISA方法进行初步筛选，如果检测结果为阴性，可据实出具检测报告；如果检测结果为阳性，则可利用小鼠生物法或液相色谱串联质谱法进行确认。检测个别样品时，考虑到成本及操作可行性，可考虑使用小鼠生物法。日常检测中将两种方法结合使用，能够更加准确检测贝类样品中DSP含量。