对苯醌在污水地下渗滤系统中的代谢路径分析

李柏萱 林琳 郑雅琴 朱刘阳 高颉 李英华

（东北大学资源与土木工程学院，辽宁沈阳 110000）

1 引言

污水地下渗滤系统（Subsurface Wastewater Infiltration System，SWIS）是一种基于自然生态原理的分散式污水处理技术，具有不产生污泥、管理方便、处理效果好、工艺流程简单［1］、运行费用低等优点，其理论研究和工程应用受到广泛关注，学者们从多个角度对SWIS 污水处理能力进行了探究。

李晓东等［2］在水力负荷为0.08 m3/（m2·d）时，对比了连续运行和间歇运行对污水地下渗滤系统污染物净化能力的影响。研究表明，干湿交替运行对污水地下渗滤系统的净化能力有显著的影响，其中干湿比为1∶1 时取得最好的净化污染物的效果。严群等［1］研究了生物基质对SWIS 脱氮效果及相关微生物的影响，结果表明，生物基质可提高SWIS 的脱氮效果，并且可以提升SWIS 中相关微生物的丰度。杨蕾等［3］研究了SWIS 微生物代谢组学在不同有机负荷、不同剖面的变化，分析了差异性产物的代谢通路，利用RDA 分析探索了该代谢产物与主要环境因子（COD，NH4+，ORP 等）的相关性，研究表明，在中等负荷下（COD＝400 mg/L），微生物代谢产物与基质层高度显著相关。Li 等［4］对比了不同服务年限（7 年和1 年）的SWIS 在污染物去除效率方面的差异，结果显示，长期服务时，SWIS 对污水中营养物质（氮和磷）的去除能力有所削弱。遗憾的是，并未针对其微观机理，尤其是微生物代谢过程的差异方面展开讨论。

代谢组学作为研究细胞和生物体的所有代谢中间体和终产物的一门新兴学科，运用核磁共振（NMR）技术、气相色谱-质谱（GC-MS）技术和液相色谱-质谱（LC-MS）技术，可实现定性、定量地分析细胞内外存在的全部低分子量产物［5］，这使得微生物的代谢产物检测以及根据代谢产物的动力过程反向推导代谢途径成为可能。在SWIS 的研究中，结合代谢组学可以更深入地了解在不同的外界条件下微生物的代谢过程、平衡机制以及调控机制，有助于更系统、深入地研究SWIS 的污染去除机理。本研究将代谢组学与SWIS 相结合，经预处理、统计分析、生物学解释获得大量的数据，探究代谢产物蕴含的生物学信息，研究了对苯醌的代谢通路，以期为揭示SWIS运行的“黑箱”机制提供数据支持。

2 材料与方法

2.1 实验装置

利用如图1 所示的模拟装置进行实验，其中1＃装置为空白对照组，进水为清水；2＃装置进水为COD浓度为500 mg/L 的模拟生活污水。模拟装置的主体为180 cm×φ30 cm（高×直径）的圆柱，从上至下，所填充基质分别为15 cm 厚的砾石、10 cm 厚的细沙以及140 cm 厚的混合基质（沙、炉渣和农田土按体积比2∶5∶13 均匀混合而成）。装置由蠕动泵泵入模拟生活污水，在土壤表层下65 cm 处设置布水管进行散水，装置底部有出水。

图1 SWIS 模拟装置

每套装置从上往下设置6 个土壤取样口，平时密封，只有采样时打开，快速采样，采样完毕即刻关闭。

2.2 实验方法

将葡萄糖（C6H12O6）、氯化铵（NH4Cl）、硝酸钾（KNO3）、亚硝酸钠（NaNO2）、磷酸二氢钾（KH2PO4）按一定比例配制成模拟生活污水，在水力负荷为0.14 m3/（m2·d）的条件下，控制布水期和落干期各12 h。待系统稳定运行后，开始计算运行时间，分别在运行10，20，30 d 时，于每个取样口取5 g 土壤，混合均匀后置于离心管中进行预处理，每个取样口取2个平行样。

取样之后，迅速用液氮对样品进行灭活，之后采用纯甲醇进行溶液提取，每次提取使用纯甲醇10 mL，每个样品提取3 次，将提取液合并在一起，置于真空中旋干，用1 mL 甲醇复溶，用离心机进行离心处理10 min，吸取上清液，装入1.5 mL 进样瓶，储存于4 ℃冰箱，待上机检测，检测采用超高效液相色谱-质谱技术（UPLC-MS）。

3 结果与讨论

3.1 数据预处理

对土样中代谢产物进行UPLC-MS 分析后，对所得色谱质谱中的波谱信号进行预处理，处理过程包括信息提取、滤噪、去卷积及归一化等。最终将波谱信号转变为一个数据集，数据集中含有检测到的513 种化合物，其中的部分化合物见表1。

表1 检测到的部分化合物

3.2 PCA 和PLS－DA 分析

对经过预处理后的数据进行多变量统计分析，主要方法有主成分分析（PCA）和偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）［6］。PCA 分析是一种通过降维将多个变量组成一组新变量，再从中选取2～3 个变量（二维平面图或三维平面图），以更多地反映原有变量信息的分析方法，通过分析可以发现观测变量与检测变量之间存在相关性或者差异性，见图2。

图2 PCA 得分图

通常进行数据分析时选取的是VIP＞1 的数据，但是由于本研究检测出来的物质中有215 种化合物的VIP＞1，因此，为了提高后续筛选的精确度并且缩小筛选的范围，选择1.5 作为筛选的VIP 临界值。运用R 语言进行作图，以运行时间为变量，以化合物峰面积为数据集，绘制出PCA 得分图。如图2 所示，10，20，30 d 的样本点都能明显分开，但是在原点附近3 个时间点的样本未完全分离，且有一些样本点有远离模型组的趋势。

为了得到更好的样本显著差异性，对这些数据进行PLS-DA 分析。PLS-DA 分析是一种常用的有监督模式多变量统计分析方法，将各组强行分类，以便发现不同组间的异同点。尤其是对于差异性不明显的样品，通过PCA 分析难以区分样品的差异性，采用PLS-DA 能更好地发现物质间的相关性和差异性。如图3 所示，在PLS-DA 得分图中，10，20，30 d的绝大部分样本点已分离，仅有个别样本点有远离模型组的趋势。因此可知，SWIS 微生物的代谢物受运行时间的长短的影响，且不同运行时段之间代谢情况存在显著差异性。

图3 PLS-DA 得分图

3.3 代谢物筛选

以VIP＝1.5 为临界值，共获取化合物47 种，占所有化合物的9.2%，说明通过VIP 得到的潜在代谢标志物之前存在差异性。对这47 种潜在代谢标志物进行结构推导，过程包括精确分子量确定、多级质谱碎片推导结构、METLIN 代谢组学数据库匹配、保留时间及相关性分析等。在经过METLIN 代谢组学数据库匹配后，保留与微生物相关的代谢产物，最终得到11 种潜在代谢标志物，见表2。

表2 潜在代谢标志物

3.4 代谢通路分析

利用KEGG 数据库对筛选获得的11 种化合物进行检索，得到相应化合物的代谢通路图，可以直观地展现代谢产物的形成过程及其在代谢过程中的相互作用。代谢通路图将物质与代谢过程及其表达的基因用方框与连线表示出来，具体地表现出化合物的形成、酶催化反应等，将代谢通路图与生物学注释结合，可明确代谢物的形成过程。共检索到3 种化合物的已知代谢通路，见表3。

表3 物质及其对应的KEGG 编号

以2-聚异戊烯基-6-甲氧基-1，4-苯醌（2-Polyprenyl-6-methoxy-1，4-benzoquinone）为例，分析其微生物代谢过程。如图4 所示，该化合物是一种聚异戊烯基苯醌，是辅酶Q（Coenzyme Q）的代谢前体，在沙门氏菌中有检出［7］。

图4 2-聚异戊烯基-6-甲氧基-1，4-苯醌的结构示意

其代谢通路如图5 所示。

图5 2-聚异戊烯基-6-甲氧基-1，4-苯醌的代谢通路

2-聚异戊烯基-6-甲氧基-1，4-苯醌的代谢起点为L-酪氨酸（L-Tyrosine），L-酪氨酸在酪氨酸转氨酶的作用下转化为3-（4-羟基苯基）丙酮酸（3-4-Hydroxyphenylpyruvate），继而在羟苯基丙酮酸还原酶作用下还原成（R）-3-（4-羟基苯基）乳酸［（R）-3-（4-Hydroxyphenyl）lactate］，然后脱水生成4-羟基肉桂酸（4-Hydroxycinnamic acid），又在辅酶A 作用下生成4-羟基苯甲酸脂（4-Hydroxybenzoic acid）。接着，4-羟基苯甲酸的代谢有两种途径：

途径1，在转移酶Coq2 的作用下转化为4-羟基-3-聚异戊烯基苯甲酸酯（4-Hydroxy-3-polyprenylbenzoate），然后在Coq3，Coq6，Coq5 等转移酶的作用下经过数次转化，最终转化为辅酶Q，其中，2-聚异戊烯基-3-甲基-6-甲氧基-1，4-苯醌是转化过程中的一个中间产物（图5）。

途径2，在转移酶UbiA 的作用下转化为4-羟基-3-聚异戊烯基苯甲酸酯，然后在UbiD，UbiX，UbiI 等转移酶、羧化酶、羟化酶的作用下经过数次转化，最终转化为辅酶Q，同样，2-聚异戊烯基-6-甲氧基-1，4-苯醌是转化过程中的一个中间产物。

4 结论

本研究对一组基于UPLC-MS 检测方法的代谢物检出数据，建立了PLS-DA 模型，分析了SWIS 中代谢产物对苯醌在稳定运行时的出现规律。从检测出的化合物中筛选得到了11 种潜在代谢标志物，其中包括己基谷氨酸（Caproyl glutamic acid）、油酸基谷氨酸（Oleoyl glutamic acid）、2-聚异戊烯基-6-甲氧基-1，4-苯醌等，利用KEGG 数据库对微生物产物对苯醌的代谢途径进行了具体的分析，阐明了其代谢过程和关键因子。