铃铛刺花提取物增强机体免疫力及运动抗疲劳作用研究

（宁波职业技术学院 浙江 宁波 315800）

铃铛刺花是一种学名为“盐豆木”的花，主要分布在我国西北及新疆地区盐碱荒漠地的一种灌木，该植物喜光、耐盐碱、耐干旱，是良好的固沙、改良盐碱地的树种。在中国西北部长期用作高产牧草，其花和嫩叶可供食用，味道鲜美，是当地人喜爱的春季食材，具有极高的营养价值。研究铃铛刺花提取物对增强机体免疫力及运动抗疲劳作用，可增强人体对疾病的抵抗力。从天然产物中筛选抗疲劳和增强机体免疫作用的有效成分、研究其作用机制具有重要现实意义。

1、实验材料

1.1、实验动物

昆明种小鼠SPF级，由新疆医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(新)2011-0004。

1.2、实验试剂

铃铛刺花提取物(浸膏)，由昌吉职业技术学院药学院提供。小鼠血清尿素氮检测试剂盒，小鼠全血乳酸检测试剂盒，小鼠肝糖原含量检测试剂盒，均为南京建成生物工程研究所提供。

1.3、实验器材

多级闪蒸锅JMF-320-A；中药多功能提取罐。

DC-TQ-30；旋转蒸发器RE-52；循环水式多用真空泵SHB-Ⅲ；Sartorius CP225D型电子天平；小鼠灌胃器；爬杆器具：自制，直径1cm，长25cm的玻璃棒，砂纸打磨后上端固定在木板上制成爬杆架，下端悬空，玻璃棒下端距离地面30cm，地面铺上2cm左右的海绵以防止小鼠落下摔伤。游泳箱：根据《保健食品检验与评价技术规范》要求自制。紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司。电热恒温水槽，上海精宏实验设备有限公司。全自动生化分析仪，日本 Beckman Coul-ter K·K。

2、实验方法

2.1、实验条件

实验条件设施齐全，将邀请运动医学及化学实验方面的老师进行技术指导，利用学员化工学院基础实验室平台进行实验，为确保本次课题能顺利的完成作出基本保障。

2.2、铃铛刺花提取液的制备

铃铛刺花提取物(浸膏)，气味清香，粘稠的棕褐色流浸膏，由昌吉职业技术学院药学院提供。样品用蒸馏水稀释成最大浓度2g·mL-1(以不堵塞灌胃针为标准)，置4℃冰箱备用。

2.3、铃铛刺花提取液抗疲劳作用

（1）爬杆实验。

取小鼠40只，雌雄各半，适应性喂养3天，随机分为4组，空白组，铃铛刺花高、中、低剂量组(4、2和1)g·kg-1，每组 10只。铃铛刺花各剂量组分别灌胃铃铛刺花提取液，1日1次，1次0.2ml/10g小鼠，空白组同样每日灌胃0.2ml/10g小鼠的生理盐水，连续10天。试验前训练小鼠两天，使其学会爬杆。末次给予受试物30min后，将小鼠放在长25cm、直径1cm、光滑的有机玻璃竿上，使肌肉处于静力紧张状态，记录小鼠由于肌肉疲劳从玻璃棒上跌落下来的时间，第3次跌落时终止实验，累计3次的时间作为爬杆时间。延长率=(给药组跌落时间-空白对照组跌落时间/空白对照组跌落时间)×100%。

（2）游泳实验。

小鼠于末次灌胃后30min，将尾根部负荷5%体质量铅块的小鼠投入自制水槽中游泳，水深30cm，水温30℃，尾部负重沙袋，同时开始计时，记录小鼠游泳开始至头部没入水面以下8s不再上浮的时间，作为小鼠负重游泳时间。

2.4、小鼠游泳后血清尿素氮、血乳酸含量测定

连续灌胃铃铛刺花提取液10天，于末次给药30min后(禁食不禁水)，将小鼠放入水深30cm，水温30℃水槽中，不负重游泳90min，休息60min后拨眼球取血0.5mL，加肝素抗凝后，以3000r·min－1离心15min，取血清，按照试剂盒的方法测定血清中的乳酸和尿素氮含量。

2.5、小鼠游泳后肝糖原含量测定

连续灌胃铃铛刺花提取液10天，于末次给药30min后(禁食不禁水)，置小鼠放入水深30cm，水温30℃水槽中，不负重游泳90min，游泳后立即处死，小鼠肝脏用生理盐水漂洗，再用滤纸吸干，称重，然后加入碱液破坏组织保留糖原，按样本重量(9mg)∶碱液体积(μL)=1:3，一起加入试管中，用冰箱保鲜膜将管口扎起，以防水分蒸发，在膜上用针头扎一小孔，以便气体热胀冷缩，沸水浴煮20min，流水冷却。按试剂盒要求将糖原水解液进一步制备成糖原检测液，测定肝糖原含量。

2.6、统计分析方法

采用SPSS 16.0统计软件对数据进行统计分析，计量资料以(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD和Dunnett比较。两组比较采用独立样本t检验(Independent-Sample T Test)。

3、实验结果

3.1、铃铛刺花提取液最大耐受量计算

铃铛刺花提取液每人每日推荐量为12g，相当于0.2g.kg-1（成人体重以60kg计），铃铛刺花流浸膏浓度为2g·ml-1生药，灌胃体积为0.02mL.g-1BW，每天灌胃3次，则计算出小鼠的最大耐受剂量MTD为：120g生药/kg小鼠，根据计算公式得出小鼠MTD相当于人用量的倍数为(小鼠体重以20g计)：

铃铛刺花急性毒性在测不出LD 50的情况下，进行了最大耐受量研究，每天给药3次的最大给药剂量，体重均有不同程度的增长，实验结束后对小鼠进行大体病理学观察，未发现有明显病理改变，全程实验动物无死亡，铃铛刺花提取液对小鼠的MTD为120g生药/kg小鼠，相当于成人临床日用量的300倍，结果证明动物完全能耐受，未出现任何毒性反应，表明铃铛刺花食用是安全的。

3.2、铃铛刺花提取液对耐力时间的影响

在爬杆试验当中铃铛刺花高和中剂量组小鼠的爬杆时间与空白对照组相比较，具有统计学差异(P＜0.01)，分别使小鼠跌落的时间延长了46.70%和47.53%，低剂量组虽无统计学意义，但也使小鼠的跌落时间延长了13.26%；在抗疲劳游泳实验中：铃铛刺花高和中剂量组小鼠的游泳时间与空白对照组相比较，具有统计学差异(P＜0.01)，但无剂量依赖性趋势，但此实验结果充分说明该药能提高抗疲劳的能力(见表1)。

表1 铃铛刺花提取液对小鼠负重游泳时间的影响(x±s)

3.3、铃铛刺花提取液疲劳代谢物指标的影响

与正常对照组比较，各给药组运动后小鼠的血乳酸含量均有降低，其中中剂量组和高剂量组与对照组比较具有显著性差异(P＜0.01)；与正常对照组比较，各给药组运动后小鼠的血清尿素氮有降低趋势，但无统计学意义(P＞0.05)。各给药组运动后小鼠的肝糖原含量均高于正常对照组，其中中剂量组和高剂量组与对照组比较具有显著性差异(P＜0.01)；表明铃铛刺提取物可以降低实验小鼠运动后的乳酸和尿素氮的含量，提高实验小鼠运动后肝糖原的含量(见表2)。

表2 铃铛刺花提取液对运动后小鼠疲劳代谢物指标的影响(x±s)

4、讨论

本试验设定的铃铛刺花提取物每人每日推荐量为12g，相当于0.2g·kg-1(成人体重以60kg计)；最大给药量试验中铃铛刺提取物，浓度为 2g·m-1，灌胃体积为 0.02ml·g-1，每天灌胃 3 次，则计算出小鼠的药物用量为：120g@kg-1，MTD相当于成人临床日用量的300倍，按体重计算，小鼠1天最大给药量相当于成人临床日用剂量的100倍以上则较为安全，表明铃铛刺提取物毒性低，动物完全能耐受，未出现任何毒性反应。《保健食品检验与评价技术规范》中对缓解体力疲劳功能的判定，认为负重游泳实验结果阳性，血清乳酸、尿素、肝糖元/肌糖元三项生化指标中任二项指标阳性，可判定该受试样品具有缓解体力疲劳的作用。本实验通过小鼠给药10天后，与空白组比较，铃铛刺花提取液中、高剂量均能明显延长小鼠的游泳和爬竿时间，3个剂量组均能降低运动后小鼠血乳酸含量，其中中剂量组(2g·kg-1)和高剂量组(4g·kg-1)与对照组的差异显著；同时3个剂量组均能提高运动后小鼠肝糖原的含量，其中中剂量组(2g·kg-1)和高剂量组(4g·kg-1)与对照组的差异显著；与正常对照组比较，各给药组运动后小鼠的血清尿素氮有降低趋势，但无统计学意义。表明铃铛刺花提取液可以显著缓解运动后小鼠的疲劳。

综上所述，铃铛刺花是一种安全的、有抗疲劳作用的植物，铃铛刺花的提取物对提高机体免疫力及运动抗疲劳的作用。