单核细胞/中性粒细胞检测、颗粒凝集法、胶体金法诊断儿童肺炎支原体感染的价值比较

许 华, 熊丽丹, 文 鹏

(江西省萍乡市妇幼保健院 检验科, 江西 萍乡, 337000)

支原体肺炎的病原体为肺炎支原体(MP), 该病以间质性肺炎为主要病理改变，近年来发病率呈上升趋势[1]。支原体肺炎早期临床症状较轻，部分患者甚至无症状，偶尔并发咽痛、发热、头痛、咳嗽等一般呼吸道症状，但临床也有死亡病例的相关报道[2]。该病发病季节不定，致病菌通过其顶端结构黏附在机体宿主细胞表面，借助微管插入细胞内吸取营养，细胞膜受到不同程度损伤，核酸酶被释放，产生过氧化氢等，细胞发生溶解，上皮细胞肿胀继而坏死[3]。MP感染能够诱发小儿咳嗽变异性哮喘，严重者甚至出现多脏器衰竭，严重威胁生命健康[4]。目前，临床诊断MP的方法较多，如血清学检测、聚合酶链式反应(PCR)检测等，虽有较好的灵敏度与准确度，但耗时较长[5]。胶体金技术具有快捷、特异敏感、稳定性强、不需要特殊设备和试剂、结果判断直观等优点，尤其适合于广大基层检验人员用来大批量检测和大面积普查等[6]。血液分析指标中，单核细胞/中性粒细胞(MONO/NEUT)指标水平与支原体肺炎具有高度相关性。本研究比较了MONO/NEUT指标检测、颗粒凝集法检测肺炎支原体(MP)抗体、胶体金法检测肺炎支原体IgM抗体(MP-IgM)对儿童MP感染的诊断价值，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年8月—2020年6月本院收治的高度符合MP感染典型症状的患儿100例作为研究对象，其中男58例，女42例; 年龄60 d～14岁，平均(7.26±2.89)岁; 体质量5～32 kg, 平均(25.33±1.36) kg; 身高0.43～1.40 m, 平均(0.77±0.23) m。纳入标准: ① 患儿表现为发热、咳嗽，年长儿童伴有厌食、畏寒、头痛、咽痛、胸骨下疼痛症状，偶见恶心、呕吐及短暂的斑丘疹或荨麻疹; ② 年龄>30 d者; ③ 依从性良好者。排除标准: ① 先天性疾病患者; ② 自身免疫性疾病患者; ③ 合并恶性肿瘤者。本研究经医学伦理委员会批准，患儿家属均同意参加本研究，并自愿签署知情书。

1.2 方法

1.2.1 颗粒凝集法: 抽取患儿静脉血标本置于真空采血管中，在4 ℃条件下静置1 h, 3 000 转/min离心10 min后分离血清，采用颗粒凝集法检测MP抗体，血清抗体滴度持续≥1∶160为阳性, MP抗体诊断试剂购自日本富士公司。

1.2.2 胶体金法: 使用珠海丽珠试剂有限公司提供的肺炎支原体IgM抗体(MP-IgM)检测试剂, 15 min内出结果(以出现阳性检测线为阳性)。将特异性抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂(抗体或单克隆抗体)吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，再移动至固定的抗原或抗体区域，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。若患儿病程<7 d, 应于病程>7 d后进行第2次检测。

1.3 观察指标

① 比较2种检测方法对不同病程患儿的阳性检出率; ② 比较2种检测方法对不同年龄段患儿的阳性检出率; ③ 比较2种检测方法的阳性检出率; ④ 以快速培养鉴定镜检法为“金标准”，比较2种方法对儿童MP感染的诊断效能(灵敏度、特异度、准确度)。以a表示真阳性，以d表示真阴性，以c表示假阳性，以b表示假阴性，准确度=(a+d)/总例数×100%, 灵敏度=a/(a+c)×100%, 特异度=d/(b+d)×100%。⑤ 比较MP阳性患儿与MP阴性患儿的MONO/NEUT指标水平。⑥ 分析MP与MONO/NEUT指标的相关性。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 2种检测方法对不同病程患儿的阳性检出率

100例患儿中，有64例入院时病程<7 d, 于病程>7 d后进行第2次检测。以快速培养鉴定镜检法为“金标准”, 100例患儿中有68例为阳性。相同病程患儿中, 2种检测方法的阳性检出率比较，差异无统计学意义(P>0.05); 2种方法对病程≥7 d患儿的阳性检出率均高于病程<7 d的患儿，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 2种检测方法对不同病程患儿的阳性检出率比较[n(%)]

2.2 2种检测方法对不同年龄段患儿的阳性检出率

相同年龄段患儿中, 2种检测方法的阳性检出率比较，差异无统计学意义(P>0.05); 2种方法对7～14岁患儿的阳性检出率均高于60 d～6岁患儿，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 2种检测方法对不同年龄段患儿的阳性检出率比较[n(%)]

2.3 2种检测方法的检测结果

68例MP阳性患儿中，颗粒凝集法的阳性检出率为86.76%(59/68), 胶体金法的阳性检出率为89.71%(61/68), 差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 颗粒凝集法、胶体金法的检测结果比较

2.4 2种检测方法的诊断效能

2种方法的灵敏度、特异度、准确度比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表4。

表4 颗粒凝集法、胶体金法的诊断效能比较 %

2.5 MP阳性患儿与MP阴性患儿的MONO/NEUT指标水平分析

MP阳性组患儿MONO/NEUT指标水平升高率高于MP阴性组, MONO/NEUT指标水平正常率低于MP阴性组，差异有统计学意义(P<0.01), 见表5。Kendall′s tau-b等级相关性检验结果显示, MONO/NEUT指标水平与MP阳性结果呈显著正相关(r=0.565,P<0.001), 即随着MONO/NEUT指标水平升高，MP阳性风险升高。

表5 MP阳性、MP阴性患儿MONO/NEUT指标情况比较[n(%)]

3 讨 论

呼吸道感染是临床常见疾病之一，病死率较高，且地区性流行情况较为严重[7]。MP是引发肺炎的临床常见病原体，属于原核生物[8]。肺炎支原体肺炎是儿童肺炎的常见类型，占儿童获得性肺炎的10%～30%, 在1～3岁儿童中较为常见[9]。儿童MP感染的临床表现缺乏特异性，临床常会出现误诊情况，导致部分患儿错失最佳治疗时机[10]。重症患儿病情进展迅速，可导致呼吸窘迫，严重者需进行机械通气，而部分患儿的神经系统、血液系统、消化系统等会受到损害。早期治疗能够有效改善患儿的治疗效果及生活质量，因此，快速有效地进行实验室诊断对于儿童MP感染的诊治尤为重要[11]。

临床资料[12]显示, MP感染的实验室诊断方法有血清学检测、病原体的分离与培养以及PCR诊断等。病原体的分离与培养在临床应用时存在诸多缺点，如标本中含有较少病原体、实验室分离培养时间较长、呼吸道污染所带的杂菌数量较多以及阳性检出率较低等，无法作为临床诊断MP感染的有效方法[13]。PCR技术操作要求严格，需配备相关实验仪器、专业操作人员以及实验室等，限制了其临床应用。血清学检测为临床检测MP感染的辅助方法，具有一定灵敏度与特异度，是利用纯化的MP抗原包被明胶颗粒，与人类血清中的MP相结合产生凝集反应[14], 但该法不能区分抗体类型，检测时间长，对于大批量病菌检测缺乏特异性。

人类感染支原体后, 1周内出现IgM抗体, 20 d后出现IgG抗体，部分患者再次感染后会出现特异性IgM抗体检测滴度较低的情况，有时甚至检测不到。对于免疫功能低下的患者或正在接受免疫抑制治疗的患者来说，检测容易出现假阳性，血清学抗体检测的参考价值有限。氯金酸在还原剂如白磷、枸橼酸钠、抗坏血酸、鞣酸等的作用下，能够聚合成一定大小的金颗粒，且因为静电作用成为一种稳定的胶体状态，形成带负电的疏水胶溶液。这种因静电作用而成的稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金法又名斑点免疫金渗滤实验、金标法及一步法，胶体金为示踪标志物，用于抗原抗体的免疫标记[15]。在MP感染的诊断中，胶体金法利用MP抗原固相硝酸纤维素膜及渗滤原理，检测IgM抗体，用于临床辅助诊断[16]。胶体金法的基本原理是弱碱环境下胶体金带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团相结合，且还能与其他生物大分子结合，在免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域已得到广泛应用[17]。

本研究结果显示，以快速培养鉴定镜检法为“金标准”, 100例患儿中有68例为病理阳性; 相同病程患儿中，2种检测方法的阳性检出率比较，差异无统计学意义(P>0.05); 2种方法对病程≥7 d患儿的阳性检出率均高于病程<7 d的患儿，差异有统计学意义(P<0.05); 相同年龄段患儿中，2种检测方法的阳性检出率比较，差异无统计学意义(P>0.05); 2种方法对7～14岁患儿的阳性检出率均高于60 d～6岁患儿，差异有统计学意义(P<0.05)。由此表明，MP感染的年龄特征和病程特征较为明确，随着患儿年龄的增长以及病程的延长，2种检测方法的阳性检出率均上升，即6～14岁和病程≥7 d儿童属于易感人群。本研究结果还显示，68例MP阳性患儿中，颗粒凝集法的阳性检出率为86.76%, 胶体金法的阳性检出率89.71%, 差异无统计学意义(P>0.05)。此外，颗粒凝集法的灵敏度、特异度、准确度与胶体金法比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。由此提示，与灵敏度、特异度较高的颗粒凝集法相比，胶体金法有着相似的诊断效能，但在耗时、仪器需求、实验室条件方面存在显著优势。此外，胶体金免疫层析技术目前已较为成熟，试剂盒也得到了工艺优化，发展为诊断试纸条，使用十分方便。

单核细胞是机体防御系统的重要组成部分，与中性粒细胞比较，其含有更多的非特异性脂酶，且具有更强的吞噬作用，机体发生炎症或相关疾病可引起单核细胞和中性粒细胞数目变化，而MONO/NEUT指标与支原体肺炎高度相关[18-19]。本研究结果显示, MP阳性患儿MONO/NEUT指标水平升高率显著高于MP阴性患儿，且MONO/NEUT指标变化与MP阳性结果呈显著正相关，故推测胶体金法联合应用MONO/NEUT指标检测对MP感染具有很好的诊断价值。但本研究仍存在不足之处，一是样本纳入量较小(胶体金法适合大批量样本操作)，二是未采用实时PCR法进行对比，有待今后改进方案进行更深入的研究。

综上所述，对于儿童MP感染，胶体金法可获得与颗粒凝集法相似的临床诊断结果，且操作方法更简单，耗时更少，对检测人员的专业素质要求更低，而MONO/NEUT指标水平与MP阳性结果呈显著正相关，故推荐将胶体金法联合MONO/NEUT指标检测应用于MP感染的临床诊断中，以获得更优的诊断效能。