血清miR-29a在胆石症患者中的表达水平及意义

卢的一 郭茂东 叶晓华

胆石症是临床常见病和多发病。近年来，随着人们饮食习惯及饮食结构的变化，胆石症的发病率逐年升高[1]。胆石症临床表现为上腹部不适、隐痛、恶心呕吐、发热寒战等[2]，按照严重程度可分为单纯性胆石症和复杂性胆石症。复杂性胆石症病变部位的炎性反应常较为严重，行手术治疗时难以准确划定病灶，导致医源性胆道损伤的发生率升高[3]。目前，临床上常用影像学方法诊断复杂性胆石症[4-5]，但Gyedu等[6]认为影像学检查在诊断复杂性胆石症时的敏感度较低。胆石症的发生、发展与胆汁淤积后胆固醇、卵磷脂及胆盐等的水平异常密切相关[7-8]。有研究表明，miR-29a可通过调节转化生长因子β1的表达介导胆汁淤积[9]，而胆汁淤积与胆石症的发生、发展存在联系。由此推测，miR-29a可能参与了胆石症的病理生理过程。目前有关miR-29a与胆石症之间关系的报道较少，本文就此开展研究，以期为临床判断胆石症的严重程度提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

前瞻性选取2016年8月至2019年8月在金华市中心医院接受治疗的143例胆石症患者作为研究对象。纳入标准：(1)均经CT或超声诊断为胆石症；(2)无梗阻性黄疸；(3)年龄≥18岁；(4)入组前未接受解痉止痛、抗感染等对症治疗；(5)签署知情同意书。排除标准：(1)合并消化道恶性肿瘤；(2)严重心、肝、肾功能不全；(3)合并胆道感染、病毒性肝炎等疾病。胆石症组中男性52例，女性91例，年龄为28～68岁，平均年龄为(46.72±5.64)岁，平均体质指数(BMI)为(22.05±3.30)kg/m2。另选取本院同期140例健康体检者作为对照组，其中男性55例，女性85例，年龄为30～65岁，平均年龄为(45.59±5.24)岁，平均BMI为(22.31±3.15)kg/m2。两组在性别、年龄、BMI方面比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究获得医院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

收集受试者的年龄、性别、BMI、高血压、糖尿病、高脂血症、心率、肝硬化、既往手术史、结石类型、腹腔积液，以及血清尿素氮、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平等资料。

采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测受试者血清miR-29a相对表达量。抽取受试者入组后空腹外周静脉血10 mL，4 ℃下4 000 r/min离心15 min，分离上层血清，置于-20 ℃冰箱待测。采用TRIzol试剂(购自美国 Thermo Fisher公司)提取总RNA，将2 μg的总RNA添加至20 μL反应液中，采用反转录试剂盒(购自美国 Thermo Fisher公司)反向转录合成cDNA，最后PCR扩增。反应条件：95 ℃ 预变性5 min，随后95 ℃ 45 s、60 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s，共45个循环。引物由美国Invitrogen公司合成，引物序列见表1。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt表示miR-29a的相对表达量。

表1 引物序列

1.3 胆石症的严重程度

143例胆石症患者中有65例为单纯性胆石症，78例为复杂性胆石症。检查结果符合下列其中1项即可诊断为复杂性胆石症：(1)胆囊严重纤维化或Calot三角粘连、瘢痕化、脂肪堆积；(2)胆囊前三角区及后三角区的腹部之间界限不清；(3)胆囊严重炎性水肿或萎缩[10]。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 胆石症组与对照组的基本资料比较

胆石症组与对照组在年龄、性别、BMI、高血压、糖尿病、高脂血症、心率、血清尿素氮方面比较，差异无统计学意义(P>0.05)。具体见表2。

表2 胆石症组与对照组的基本资料比较

2.2 胆石症组与对照组血清miR-29a相对表达量比较

胆石症组患者血清miR-29a相对表达量为1.15±0.28，高于对照组(0.76±0.23)，差异有统计学意义(t=12.815，P<0.001)。

2.3 单纯性胆石症组与复杂性胆石症组患者血清miR-29a相对表达量比较

单纯性胆石症组患者血清miR-29a相对表达量为0.91±0.26，低于复杂性胆石症组(1.35±0.21)，差异有统计学意义(t=8.726，P<0.001)。血清miR-29a预测复杂性胆石症的ROC曲线下面积(AUC)、敏感度、特异度、最佳截断点、最大约登指数分别为0.842(95%CI：0.771～0.897)、71.79%、84.62%、1.15、0.564。见图1。

2.4 单纯性胆石症组与复杂性胆石症组患者的基本资料比较

两组在年龄、性别、高血压、糖尿病、既往手术史、结石类型方面比较，差异无统计学意义(P>0.05)。与复杂性胆石症组相比较，单纯性胆石症组患者中肝硬化、腹腔积液占比以及血清TC、TG、LDL-C水平较低，HDL-C水平较高，差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表3。

图1 血清miR-29a预测复杂性胆石症的ROC曲线

2.5 影响复杂性胆石症发生的相关因素

本研究将既往手术史(无=0，有=1)、TC(<4.48 mmol/L=0，≥4.48 mmol/L=1)、肝硬化(否=0，是=1)、腹腔积液(否=0，是=1)、TG(<2.41 mmol/L=0，≥2.41 mmol/L=1)、LDL-C(<2.66 mmol/L=0，≥2.66 mmol/L=1)、HDL-C(>1.38 mmol/L=0，≤1.38 mmol/L=1)、miR-29a(<1.15=0，≥1.15=1)作为自变量，α入=0.05，α出=0.10，将胆石症严重程度(单纯性胆石症=0，复杂性胆石症=1)作为因变量纳入Logistic回归分析，结果显示肝硬化、腹腔积液、TC、miR-29a与复杂性胆石症的发生密切相关。见表4。

表3 单纯性胆石症组与复杂性胆石症组患者的基本资料比较

表4 影响复杂性胆石症发生的相关因素

3 讨论

有报道指出，miR-29a可通过外源性凋亡途径减轻胆管结扎后胆汁淤积性肝损伤和肝纤维化[11]；且miR-29a与机体血糖稳定密切相关，可参与机体葡萄糖的摄取，维持机体葡萄糖平衡，并对胰岛素分泌及抵抗过程起到调节作用[12]。Wu等[13]发现miR-29a与2型糖尿病患者的血清TC、载脂蛋白A1水平呈正相关，可直接反映糖脂代谢紊乱的程度，其原因可能与miR-29a具有稳定血糖的功能，可抑制脂质转化为糖，致使脂质代谢物在体内积聚有关。胆石症的发生、发展与机体糖脂代谢紊乱密切相关，当TC呈过饱和状态时，易析出结晶而形成结石；而miR-29a可诱导胆汁淤积，导致胆石症发生。本文进一步对miR-29a与胆石症严重程度的关系展开研究。

本研究结果发现，胆石症组患者血清miR-29a相对表达量高于对照组，表明miR-29a可能参与了胆石症的发生过程。此外，研究结果进一步指出，复杂性胆石症患者血清miR-29a相对表达量高于单纯性胆石症患者，表明miR-29a可能与胆石症的发展存在联系，提示检测血清miR-29a有助于判断胆石症的严重程度。本研究构建了miR-29a评估复杂性胆石症的ROC曲线，结果发现miR-29a评估复杂性胆石症的AUC高于0.8，表明miR-29a判断胆石症严重程度的效能较好。为明确miR-29a与复杂性胆石症的关系，本研究采用多因素Logistic回归分析复杂性胆石症的影响因素，结果显示肝硬化、腹腔积液、TC、miR-29a与复杂性胆石症的发生密切相关，其原因可能为肝硬化患者的胃肠激素如胆囊收缩素水平下降，胆囊收缩运动受到抑制，导致胆石症的发生、发展[14]；胆囊长期浸泡于腹腔积液中，易造成胆囊壁加厚，甚至发生纤维化，导致胆囊收缩力下降，胆汁淤积形成结石[15]；TC代谢障碍可导致TC在胆囊大量积聚，诱发胆结石的形成[16]。

有研究表明，胆汁淤积与胆石症的发生、发展密切相关，而氧化应激反应与胆汁淤积密切相关[17-18]。活性氧是参与氧化应激反应的重要物质，主要来源于线粒体。当胆汁淤积时，过多的胆红素和胆汁酸积聚，引起肝细胞坏死及肝细胞膜脂质过氧化，释放大量的活性氧，激发氧化应激反应，进一步损伤肝细胞和毛细胆管细胞，引起胆管内胆汁的分泌和排泄异常[19]。miR-29a可调节活性氧的表达水平，并可直接调节Ⅰ型胶原蛋白α1的表达，从而减轻胆管结扎后胆汁淤积[20]。由此推测，miR-29a可能通过调节活性氧及胆汁淤积情况，参与胆石症的疾病进展。

综上所述，胆石症患者血清miR-29a相对表达量明显升高，其可能参与了胆石症的疾病进展，检测miR-29a表达水平有助于诊断复杂性胆石症。本研究存在一定不足，比如未动态检测胆石症患者血清miR-29a相对表达量，且未明确miR-19a影响胆石症病情进展的病理生理机制，下一步将进行基础研究，对miR-29a影响胆石症进展的病理生理机制进行探究。