卤虫作为生物饵料传播虾类病原风险的研究进展

2020-11-03王一婷史成银隋丽英叶仕根

中国动物检疫 2020年11期

王一婷，史成银，隋丽英，叶仕根，董宣，黄倢

（1.大连海洋大学，辽宁大连 116023；2.中国水产科学研究院黄海水产研究所，青岛海洋科学与技术试点国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室，农业农村部海水养殖病害防治重点实验室，青岛市海水养殖流行病学与生物安保重点实验室，山东青岛 266071；3.天津科技大学，天津 300457）

卤虫（Artemia）也称丰年虾或丰年虫（brine shrimp），是一种典型的无选择性滤食小型甲壳类动物，属于节肢动物门（Arthropoda）、甲壳动物亚门（Crustacea）、鳃足纲（Branchiopoda）、无甲目（Anostraca）、卤虫科（Artemiidae）、卤虫属（Artemia）[1]，广泛分布于沿海日晒盐场和内陆盐湖等高盐水体中[2]。卤虫具有营养价值高、休眠卵易保存、孵化操作简单等优点，被广泛用于水产育苗尤其是虾类育苗，是虾类繁育的重要生物饵料[3-4]。我国是水产养殖大国，2018 年海水养殖虾产量达140.91 万t[5]。我国对卤虫卵需求量居于世界首位，占全球总需求量的50%左右。目前市场上流通的卤虫卵大部分来自中国、美国、俄罗斯、中亚国家的内陆盐湖，少部分来源于沿海日晒盐场和人工养殖区域[6-7]。

原良种场是水产养殖业的基础，其苗种质量至关重要，是保障水产养殖业健康发展的根本[8-9]。卤虫是虾蟹类育苗环节的关键生物饵料，其是否携带虾类致病病原已受到多方关注，但暂未有关于卤虫可被虾类病毒感染的报道。本文系统梳理了卤虫作为生物饵料传播虾类病原的研究进展，以期为正确使用卤虫等生物饵料提供技术支持。

1 卤虫的人工感染试验方法

关于卤虫传播虾类病原的相关研究大多数采用人工感染方式，包括浸泡法和掺病毒饲喂法（viral feeding mixture）[10-11]，具体见表1。掺病毒饲喂法是将病毒粗提液与卤虫食物混合，使病毒吸附在卤虫食物表面，当卤虫摄食带有病毒粘附的食物时，病毒会随着食物进入到卤虫体内并富集，从而使卤虫携带病毒[10-17]。

卤虫一般以浮游藻类、酵母、豆粉、米糠等为食。根据食物种类不同，掺病毒饲喂法暂分为两类：一类是以浮游植物作为食物与病毒粗提液混合，即病毒-浮游植物吸附法（virus-phytoplankton adhesion）[12]；另一类将米糠与病毒粗提液混合，即病毒-米糠吸附法（virus-rice bran adhesion）。目前尚无报道哪一种感染方式更适合研究卤虫作为虾类病原的媒介生物，但不同感染方式在感染效果上的确存在差异。此外，不同病毒检测手段也会产生不同的感染效果评价。

2 卤虫可能是某些虾类病毒的传播载体

卤虫是否能感染虾类病毒受到了较多关注，不少研究者开展了虾类病毒对卤虫的感染及卤虫传播虾类病毒的风险研究，通过PCR 等高灵敏的检测技术，使人们认识到卤虫存在传播虾类病毒的风险。但多数研究由于缺少组织病理学、原位杂交、电镜细胞病理学的直接证据，尚未能证实卤虫能被这些虾类病毒感染。然而，卤虫作为载体传播虾类病原的风险不容忽视。

2.1 白斑综合征病毒（white spot syndrome virus，WSSV）

张家松等[13-14]采用病毒-浮游植物吸附法和浸泡法，对4 种不同发育阶段（无节幼体、后无节幼体、拟成虫、成虫）的卤虫进行攻毒试验。攻毒感染时长为5 d，攻毒2 次/d，第6～7 天投喂相同密度的湛江等鞭金藻（Isochrysiszhanjiangensis）；经饥饿24 h 后选取10～50 尾不同发育时期的卤虫进行PCR 检测。浸泡组采用相同浓度的病毒粗提液进行浸泡，感染2 次/d，3 h/次，之后用消毒海水冲洗，其余处理方法同病毒-浮游植物吸附组。套式PCR 检测发现，对照组和浸泡组卤虫皆呈WSSV 阴性，而病毒-浮游植物吸附组不同发育阶段卤虫皆为WSSV 阳性。用病毒-浮游植物吸附法处理后的卤虫投喂凡纳对虾（Penaeus vannamei）仔虾，经套式PCR 检测显示对虾皆为WSSV 阳性；但采用VP28 特异性囊膜蛋白的反转录PCR（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）检测，显示不同发育阶段卤虫皆为WSSV 阴性。同时，用对照组、浸泡组和病毒浮游-植物吸附组的卤虫投喂凡纳对虾仔虾，发现死亡率差异不显著。该研究表明：通过病毒-浮游植物吸附法可以使卤虫携带WSSV，但对VP28-mRNA 进行RT-PCR 检测，未检测到WSSV在卤虫体内复制，因此推测卤虫是WSSV 的机械携带者。

2.2 传染性肌坏死病毒（infectious myonecrosis virus，IMNV）

Da Silva 等[15]采用病毒-浮游植物吸附法和浸泡法对卤虫成虫进行IMNV 感染试验，经RTPCR 检测，显示两种感染途径下的卤虫皆为阳性，但卤虫并没有明显的发病迹象。用上述两种途径感染后的卤虫投喂凡纳对虾幼虾，显示幼虾的IMNV阳性率不同，病毒-浮游植物吸附组阳性率大于40%，而浸泡组阳性率仅为10%。后经荧光定量PCR 检测，两种感染途径下的幼虾病毒载量差异不显著，因此推测卤虫能作为IMNV 的传播载体。虽然在攻毒15 d 内并没有发生幼虾大量死亡，但卤虫作为IMNV 的传播载体不应该被忽视。

2.3 肝胰腺细小病毒（hepatopancreatic parvovirus，HPV）

Sivakumar 等[11]采用病毒-米糠吸附法和浸泡法，对不同发育阶段（无节幼体、后无节幼体、幼虫、拟成虫、成虫）的卤虫进行攻毒试验，收集攻毒后的卤虫用于感染斑节对虾（P.monodon）仔虾。对病毒-米糠混合和浸泡感染组不同阶段的卤虫进行PCR 检测，结果除无节幼体外，其余4 个阶段卤虫检测结果皆为阳性，但未发现卤虫死亡。将感染后的卤虫投喂斑节对虾仔虾，两种感染途径下卤虫均可使斑节对虾仔虾出现死亡，但对照组未发生死亡，表明卤虫可能是HPV 的传播载体。

2.4 罗氏沼虾野田村病毒（Macrobrachium rosenbergii nodavirus，MrNV）和极小病毒（extra small virus，XSV）

Sudhakaran 等[16]采用病毒-米糠混合法和浸泡法，对不同发育阶段（无节幼体、后无节幼体、幼虫、拟成虫、成虫）的卤虫进行MrNV和XSV 感染试验，将攻毒后卤虫投喂罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）仔虾。结果显示：用病毒-米糠吸附法和浸泡法感染后，5 种不同发育阶段的卤虫套式RT-PCR 检测结果皆为阳性，但两种感染组卤虫死亡率与对照组差异不显著。用攻毒后的卤虫直接投喂罗氏沼虾仔虾，显示两种感染组仔虾分别在攻毒后第8 天和第9 天全部死亡，并出现典型白尾病（white tail disease，WTD）症状，发病虾中MrNV 和XSV 套式RT-PCR 检测结果也为阳性。对照组仔虾未出现死亡，且MrNV 和XSV 套式RT-PCR 检测结果均为阴性。因此判断卤虫可能成为MrNV 和XSV 的传播载体，可以增加幼虾患白尾病的风险。

2.5 斑节对虾杆状病毒（Penaeus monodon baculovirus，MBV）

Sarathi 等[17]采用病毒-米糠吸附法和浸泡法，对不同发育阶段（无节幼体、后无节幼体、幼虫、拟成虫、成虫）的卤虫进行MBV 感染试验，并将攻毒后的卤虫投喂斑节对虾仔虾。结果显示：病毒-米糠吸附法和浸泡法感染后，5 个发育阶段的卤虫经套式PCR 检测皆为阴性[17]，将感染后的卤虫无节幼体投喂斑节对虾仔虾，发现两组斑节对虾仔虾在感染后15 d 内未出现死亡，且经套式PCR检测皆为MBV 阴性；然而同批感染试验中，投喂MBV 病料的斑节对虾仔虾在感染15 d 后死亡率达到了80.1%。所以，关于卤虫是否能成为MBV 的传播载体需进一步研究。

3 卤虫可感染多种致病弧菌

Defoirdt 等[18]研究表明，卤虫可以被多种水产致病弧菌感染，如哈维氏弧菌（V.harveyi）、鳗弧菌（V.anguillarum）、坎贝氏弧菌（V.campbellii）和副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）。有文献[19]报道：随着卤虫卵孵化，弧菌会大量繁殖，在卤虫卵孵化前，部分测试弧菌可通过胚胎外膜屏障进入并定植于卤虫胚胎内，可导致孵化卤虫产量减少10%。海洋弧菌是危害海水养殖生物的重要致病病原，不仅对卤虫生长发育产生影响，也严重危害了虾类养殖业。弧菌可导致对虾患病，如哈维氏弧菌通过幼虾体表的伤口以及消化道侵染幼虾，使幼虾患病甚至死亡[20]。鳗弧菌质粒可携带许多毒力因子，如细菌鞭毛蛋白、胞外蛋白酶、细胞外溶血素等，严重影响养殖对虾健康[21-22]。副溶血弧菌是危害水产养殖业的重要病原之一[23-24]，尤其是带有pVA1 型质粒的副溶血弧菌可以使对虾患急性肝胰腺坏死病（AHPND）而出现急性死亡，死亡率高达100%[24-26]。虽然目前未有卤虫能够在自然环境下感染携带pVA1 型质粒的副溶血弧菌的报道，但带有pVA1 型质粒的副溶血弧菌可在试验条件下感染卤虫无节幼体，且影响卤虫存活率[25]。对副溶血弧菌毒力蛋白PirABVP进行纯化后感染卤虫无节幼体，在感染0、12、36、48 和60 h 后进行免疫组化分析和电镜观察，显示卤虫中肠和后肠的上皮细胞受到破坏，导致核固缩、细胞空泡化，线粒体和粗面内质网产生不同程度损伤[26]。加之，卤虫易感的坎贝氏弧菌也可以携带pVA1 型质粒[24]，提示卤虫可能存在传播AHPND 致病菌的风险。

4 警惕卤虫传播虾肝肠孢虫（Enterocytozoon hepatopenaei，EHP）的风险

已有报道[27]称，可在卤虫中检测到EHP。另外Karthikeyan 等[28]采用浸泡法对卤虫无节幼体进行攻毒试验，待卤虫无节幼体发育到后无节幼体、幼体、拟成虫幼体、成虫不同阶段后进行PCR 检测，显示5 个不同发育阶段卤虫EHP 检测均为阳性；对卤虫成虫进行组织切片，观察到卤虫成虫体内有孢子样包涵体，但是卤虫并没有明显的发病迹象；将阳性卤虫无节幼体投喂给凡纳对虾仔虾后，经PCR 检测凡纳仔虾EHP 结果也为阳性，这提示应重视卤虫携带并传播EHP 的风险。本研究团队最近对卤虫进行了EHP 感染试验，并用原位环介导等温扩增（ISDL）进行了检测。结果显示，EHP阳性信号只出现在感染3 d 后的卤虫组织中，感染7 d 后阳性信号消失；用卡尔科夫罗尔试剂对卤虫进行染色，可观察到大量孢子样荧光，但EHP 的PCR 检测为阴性，说明Karthikeyan 等观察到的可能不是EHP 的孢子。

5 防控建议

5.1 系统开展卤虫的病原学和流行病学研究

目前关于卤虫是否可以传播虾类病原的相关试验，多数是通过人工感染的方法来探究，大部分研究未经过电镜、免疫组化、原位杂交等方法确认卤虫是否为虾类病原的宿主或媒介。而且据李富文[29]报道，卤虫还可以携带聚缩虫、假单胞菌、肠杆菌、沙门氏菌等病原。2019 年，农业农村部等十部委联合下发的《关于加快推进水产养殖业绿色发展的若干意见》明确指出“加强疫病防控，落实全国动植物保护能力提升工程，健全水生动物疫病防控体系，加强监测预警和风险评估，强化水生动物疫病净化和突发疫情处置，提高重大疫病防控和应急处置能力”。卤虫等作为水产养殖尤其是虾类育苗的关键生物饵料，其病原学和流行病学目前在我国并未引起足够重视，建议加强支持开展卤虫的病原学和流行病学研究，加强进口卤虫的检验检疫，系统分析卤虫病原在我国虾类养殖、苗种产业和野生生物中的流行病学特征及其风险，掌握其致病性、传播模式等病原学特征基础信息，研发病原检测技术，为开展病害检测、监测和有效防控提供基础理论支撑。

5.2 规范卤虫卵生产管理和孵化操作

建立卤虫卵采购、储存、加工和孵化的标准和规范。该规范应该包括风险病原检疫、隔离、孵化率评估和孵化卤虫幼体质量评价。在卤虫卵孵化过程中伴随着细菌的大量繁殖，为避免将细菌带入养殖水体中，在卤虫卵孵化前应对孵化海水和设施工具进行消毒。建议将孵化过程分解为虫卵脱壳、孵化、收集和后处理4 个过程。脱壳过程中，可边搅拌边加入一定剂量的次氯酸钠（NaClO），至肉眼观察壳已脱净且卵呈现棕红色时，应立即停止脱壳。收集脱壳卵并用海水充分冲洗，进一步浸入硫代硫酸钠溶液中漂洗，取出后再次冲洗，置于孵化装置中。孵化温度宜控制在28～30 ℃，收集孵化后的卤虫，再次消毒后分装，有条件的可进行速冻，以最大限度降低卤虫携带活菌的风险。但此过程仅对细菌效果明显，对于病毒性病原，可尝试采取辐照等方式降低传播风险。

5.3 探索卤虫生物安保产业发展途径

目前，无特定病原（specific pathogen free，SPF）技术在畜牧和水产育种中已得到广泛应用。也正是由于建立了SPF 培育技术，使得凡纳对虾由美洲的区域性品种变为全球性养殖且产量最大的水产养殖品种[8]。由于卤虫卵来源于盐湖和日晒盐场，要做到SPF 卤虫卵规模化生产有较大难度，建议探索实施卤虫生物安保产业发展途径，包括但不限于以下几个方面的技术方案：（1）按使用目的评估卤虫产区的生物风险，例如有虾类致病风险的卤虫源不供给到虾类育苗场，或者供给到低生物安保要求的虾类育苗场；（2）构建卤虫卵采收加工链的风险管理和生物安保体系；（3）建立卤虫病原高通量鉴定和检测技术；（4）研发卤虫病原净化技术；（5）研究无特定病原卤虫的整个生态替代方案；（6）探索和评估发展工厂化高密度人工卤虫培养技术的可行性。

5.4 探索替代产品

卤虫和桡足类都是水产育苗过程中的常用生物饵料。据报道桡足类也可检出WSSV[30]。随着高通量测序和生物信息学技术的快速发展，越来越多的海洋脊椎和无脊椎动物新病毒被发现[31-32]，而卤虫、桡足类、虾类同属于甲壳动物，仍然存在传播虾类病原的风险。建议开发水产养殖鲜活饵料的替代产品，如合成饲料、微囊饵料等。另外，近年来有团队尝试使用摇蚊幼虫等昆虫幼虫作为水产育苗的生物饵料，昆虫幼虫蛋白含量高，人工养殖体系相对成熟，更为重要的是昆虫幼虫的生长过程可远离水产养殖区域，并且与甲壳动物的亲缘关系更远，可大大减少传播虾类病原的风险。