烟薯多糖的提取·鉴定及其抗氧化活性研究

邓甜 田小鹏 冯艳丽

摘要 多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗衰老以及降血糖等多种生物活性，具有广泛的应用价值。该研究利用热水浸提法从烟薯25中提取到多糖，多糖得率为0.6%。所提取的多糖能够被α-淀粉酶和变聚糖酶水解，表明该多糖主要含有α-1，3-糖苷键与α-1，4-糖苷键;不能被右旋糖酐酶水解。经红外光谱分析，该多糖属于α型吡喃糖。该多糖具有良好的抗氧化作用，能够清除DPPH、羟自由基、超氧阴离子自由基，其IC50分别为2.09、1.27、2.47  mg/mL，具有良好的应用前景。

关键词 烟薯;多糖;抗氧化活性

中图分类号 S531  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2020）19-0170-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.19.044

Abstract Polysaccharides have a variety of biological activities such as immuno regulation，antitumor，antiaging，and hypoglycemia，which have been widely used in many fields.In this study，we extracted polysaccharides from Yanshu 25 by the method of hot water extraction.The yield of polysaccharides was 0.6%.The oligosaccharides could be produced after incubated with αamylase and mutanas.The polysaccharides were comprised with α1，3 and α1，4glycosidic bonds.According to infrared spectrum analysis，the polysaccharide belonged to αpyranose.The polysaccharide could scavenge DPPH，hydroxyl radical and superoxide radical，and the IC50 was 2.09，1.27，2.47 mg/mL，respectively.The polysaccharides from Yanshu 25 had good application prospect.

Key words Yanshu;Polysaccharide;Antioxidant activity

基金項目 江苏省研究生科研与实践创新计划项目（KYCX18_2573;KYCX18_2586）。

作者简介 邓甜（1994—），女，贵州铜仁人，在读硕士，从事海洋微生物及活性物质研究。*通信作者，吕明生，教授，硕士生导师，从事海洋微生物、生物技术研究;王淑军，教授，硕士生导师，从事海洋微生物及其活性物质研究。

收稿日期 2020-03-16

甘薯在世界各地的热带、亚热带均有广泛种植，中国甘薯的种植面积及产量位居世界第一。甘薯中富含膳食纤维、花青素、胡萝卜素、维生素、氨基酸、矿物质和多糖等多种活性物质，具有很高的营养价值[1]。烟薯25是由烟台市农业科学院通过杂交技术选育而成，具有较好的耐贮性、抗病性，可溶性糖含量较高，是优质、高产、抗病性好的食用型新品种，利用灰色多维综合分析评价食用型甘薯品种，结果表明烟薯25产量和综合评估均排在第一位[2]。

多糖是指由醛糖或者酮糖以糖苷键链接形成的天然高分子聚合物，广泛存在于自然界的许多生物中，是维持生命活动的基本物质[3]。20世纪50年代就发现来源于真菌的多糖具有抗癌效果，之后越来越多的研究者对多糖的理化性质进行了研究[4]。目前已报道有300多种天然多糖化合物来源于动物、植物以及微生物[5]。多糖不仅具有免疫调节、抗肿瘤、抗衰老、降血糖等生物活性，还具有毒副作用小、不易造成残留等特点，越来越多的人研究其在食品、保健品中的应用[6]。该研究以烟薯25为材料，从中提取出多糖，对其结构进行初步研究，并研究其体外抗氧化活性，从而提高烟薯25的应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 烟薯25购买自冠县畅享贸易有限公司;变聚糖酶（Mutanase）与右旋糖酐酶（Dextranase）为江苏省海洋资源与环境重点实验室制备，α-淀粉酶（α-Amylase）购买自Aladdin; 60F254 硅胶板购买自Sigma;其他试剂均为国药化学分析纯。

1.2 方法

1.2.1 烟薯多糖的提取。将1 kg烟薯25清洗干净，去皮后切块自然晾干，然后粉碎得烟薯粉末，加入无水乙醇浸泡48 h 脱脂，取出后自然晾干。将脱脂后的烟薯粉末加入10倍质量的蒸馏水置于烧杯中，在85  ℃下采用热水浸提2 h，并不断用玻璃棒搅拌，然后离心收集上清得提取液。将提取液进行减压浓缩得到浓缩液，然后加入3倍体积的无水乙醇，在4 ℃下浸泡24 h，然后离心取沉淀使用真空干燥。将干燥后的粉末使用蒸馏水溶解至浓度为10 mg/mL，使用Sevage法脱蛋白后，再使用0.45 μm纤维滤膜过滤，然后使用规格为3 500 Da 透析袋在蒸馏水中透析48 h，期间不断更换蒸馏水，然后将透析液真空干燥得到烟薯粗多糖。

1.2.2 烟薯多糖含量测定。

将提取的多糖称取1 g，溶于100 mL 蒸馏水中，使用0.45 μm滤膜过滤，然后使用硫酸苯酚法测定其总糖含量[7]，使用DNS法测定其还原糖含量[8]，使用BCA蛋白浓度试剂盒测定其蛋白含量，计算所提取物质中多糖含量及提取率。

1.2.3 TLC分析烟薯多糖酶解产物。将提取的烟薯多糖分别与变聚糖酶、右旋糖酐酶以及α-淀粉酶在35 ℃、pH 6.5下反应24 h后，沸水浴1 min灭活，1 000 r/min离心1 min，然后各取0.5 μL使用型号60F254硅胶板进行薄层层析（thinlayer chromatograph，TLC）分析水解产物。其展开剂为5 mL正丙醇、2 mL乙酸乙酯、8 mL乙腈、1 mL乙酸、4.5 mL去离子水;显色剂为0.2 g地衣酚、10 mL浓硫酸、80 mL无水乙醇、10 mL去离子水，在85 ℃下显色5 min。以葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖和麦芽七糖标准品为对照。

1.2.4 红外光谱分析烟薯多糖。

使用FT-IR光谱对烟薯多糖结构进行分析。将多糖与溴化钾在90 ℃烘箱中干燥12 h，然后将干燥的多糖样品1 mg与100 mg溴化钾粉末混合，研磨并压片，然后在波数4 000～400 cm-1内记录IR光谱。

1.2.5 烟薯多糖的抗氧化活性分析。

1.2.5.1 DPPH清除率。

1.2.5.4 还原力测定。200 μL多糖+200 μL PBS（0.2 mmol/L，pH6.6）+200 μL K3[Fe（CN）6]，50 ℃温育20 min，然后加入200 μL 10%TCA，混合后5 000 r/min离心10 min，取500 μL上清+2.5 mL蒸馏水+100 μL 0.2%FeCl3，室温放置10 min后测OD700，制作曲线，并以VC为对照。

2 结果与分析

2.1 烟薯多糖提取

从2 000 g烟薯中提取到10.2 g烟薯粗多糖，其中总糖含量为6.1 mg/mL，还原糖含量为0.217 mg/mL，得到6 g多糖，其多糖得率为0.60%。而苏瑞丽等[9]使用热水浸提法从市售的红皮白心红薯、红皮红心红薯、白皮红心红薯和红皮紫心红薯中提出的多糖得率分别为0.22%、0.28%、0.26%和0.40%，烟薯多糖的含量远高其他甘薯。

2.2 TLC分析烟薯多糖酶解产物 由图1可知，烟薯多糖能够被变聚糖酶水解产生少量麦芽七糖，不能够被右旋糖酐酶水解，能够被淀粉酶水解产生不同分子量的麦芽糖。变聚糖酶能够水解α-1，3-糖苷键[10]，右旋糖酐酶是专一性水解α-1，6-糖苷键[11]，α-淀粉酶能够水解淀粉、糖原或多糖中的α-1，4-糖苷键[12]。该多糖能够被淀粉酶水解以及少量被变聚糖酶水解，表明该多糖中主要含有α-1，4-糖苷键以及α-1，3-糖苷键，但不能被右旋糖酐酶水解，表明该多糖含有α-1，6-糖苷键很少，或是所含的α-1，6-糖苷键的支链较短，右旋糖酐酶无法结合水解。

2.3 FT-IR分析烟薯多糖

在波数3 000～2 800 cm-1处出现较宽的吸收峰是C—H键的拉伸振动，这是多糖物质的特征吸收峰[13]。由图2可知，该多糖具有典型的多糖特征吸收峰。在2 930 cm-1处有较强的吸收峰，为CH3、CH2、CH的C—H伸缩振动引起的[14]。在1 023 cm-1处的吸收峰为吡喃型糖环特征吸收峰[14]。1 081 cm-1处的吸收峰是由糖醛上的C—OH伸缩振动引起的[15]。在846 cm-1处的吸收峰为α型的C—H角变振动吸收峰，说明该多糖为α型多糖[16]。赵国华等[17]曾从甘薯中提取到甘薯多糖 SPPS-I-Fr-Ⅱ组分，是一种含有α-1，6-糖苷键的α型吡喃糖。

2.4 烟薯多糖抗氧化活性 由图3可知，从烟薯中提取到的多糖能够有效清除DPPH、羟自由基以及超氧阴离子自由基。当多糖浓度为1 mg/mL时，对超氧阴离子与羟自由基的清除率分别为33.8%和54.0%，与田春宇等[18]从甘薯PST一号提取的多糖相比，其在相同浓度下对超氧阴离子自由基与羟自由基的清除率仅为22.5%和25.4%。当多糖浓度为2 mg/mL时，能够清除49.0%DPPH、49.2%超氧阴离子自由基以及61.0%羟自由基。当多糖浓度为10 mg/mL时，能够清除81.6%的DPPH、85.6%羟自由基以及64.1%超氧阴离子自由基。当多糖浓度为8 mg/mL时，其羟自由基的清除能力比相同浓度下的香菇多糖与黑木耳多糖高12.8%与34.27%[19];其DPPH清除能力是陈安徽等[20]从蛹虫草中提取的多糖的2.06倍;其对DPPH、羟自由基、超氧阴离子自由

基清除能力是蕨麻多糖的2.62、11.14、2.06倍[21];其对超氧阴离子自由基及羟自由基的清除能力是山药多糖的1.25、7.32倍[22]。该多糖还具有一定的还原能力，当浓度为2 mg/mL时，其还原能力相当于0.002 mg/mL VC的还原能力。来源于烟薯25的多糖是良好的天然抗氧化活性药物，在保健品及食品中具有很高的应用价值。

3 结论

该研究使用热水浸提法从烟薯25中提取到一種烟薯多糖，多糖得率为0.6%。该多糖能够被α-淀粉酶水解为不同分子量的寡聚糖，以及变聚糖酶水解产生麦芽七糖，该多糖中以α-1，3-糖苷键与α-1，4-糖苷键为主。该多糖在红外光谱中具有多糖特征吸收峰，多糖为α型吡喃糖。多糖在体外具有良好的抗氧化作用，对DPPH、羟自由基以及超氧阴离子自由基具有很好的清除作用，IC50分别为2.09、1.27、2.47  mg/mL。烟薯多糖有良好的抗氧化活性，具有良好的应用前景。

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