败酱草总黄酮部位体外抗病毒活性成分研究

王文琪，李媛媛，王双，朱彦军，孙梦佳，蔡馥洁，孙晓慧，柳晴，周洪雷

(山东中医药大学 药学院，山东 济南 250355)

败酱草(Patrinia Herb)是败酱科植物白花败酱、黄花败酱的全草，黄花败酱为主要品种，又名龙芽败酱、黄花龙牙、苦菜、鹿肠等，始载于《神农本草经》，中医认为败酱草味辛、苦，性凉，入胃、大肠、肝经，有清热解毒，消痈排脓，活血行瘀和抗病毒的功效，用于治疗肺痈、肠痈、痈肿疮毒以及赤白带下，产后瘀阻腹痛等[1]。

目前，已证实败酱草水提液对呼吸道合胞病毒(RSV)具有显著抑制作用[2]。现在治疗病毒性疾病的大多为干扰素及核苷类药物，存在副作用大、易反复、耐药性显著、价格昂贵且疗程长等不足。而中药对病毒具有多重作用，毒副作用小，很少产生耐药性，能增强机体免疫功能，具有较为显著的优势。

败酱草为我国传统中药，在国内南北各地均有分布，其有效成分主要为黄酮、三萜皂苷、环烯醚萜、挥发油、甾醇、香豆素、木脂素等[3]，近年来研究发现该药具有广泛的药理作用和很高的临床药用价值[4]。

谭超等[5]发现黄花败酱草的蒸馏液部位在体外对大肠杆菌、链球菌、金黄色葡萄球菌的抑菌活性较强，而醇提部位的抑菌活性不高。Xu等[6]发现败酱草水提部位有明显的抗HIV病毒活性。但败酱草总黄酮部位的具体抗病毒活性成分的报道并不多见。本文采用细胞病变法对败酱草总黄酮部位进行体外抗病毒活性筛选，并通过LC-MS对其活性成分进行定性分析，为败酱草抗病毒活性的深入研究奠定基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器

CO2恒温培养箱(日本SANYO)；生物安全柜(济南鑫贝西公司)；酶标仪，四级杆-静电场轨道阱超高分辨质谱仪，UltiMate3000 超高相液相色谱仪(Thermo Fisher Scientific)。

1.2 材料

细胞株：非洲绿猴肾细胞(vero)(RSV、HSV-1敏感细胞)、横纹肌瘤细胞(RD)(EV-71敏感细胞)来自山东省医学科学院基础医学院研究所微生物室。

病毒株：呼吸道合胞病毒(RSV)、肠道 EV-71 病毒(EV-71)、单纯疱疹 I 型病毒(HSV-1)来自中国疾病预防控制中心病毒病研究所流感病毒研究室。

对照品：绿原酸(批号：161146-160831)、咖啡酸(批号：161181-161020)、木犀草苷(批号：161165-160918)(江苏永健医药科技有限公司)；山奈素(批号：S24N7D25625)、槲皮素(批号：C20J6Y1722)、山奈酚(批号：C26J8Y38642)(上海源叶科技有限公司)；芦丁(批号：BCY-000507，江西佰草源生物科技有限公司)。

2 方法与结果

2.1 样品的制备

取败酱草50 g粉碎，6倍量石油醚(沸程60～90 ℃)回流脱脂(2次，每次1 h)，12倍量水85 ℃条件下温浸(3次，每次2 h)，合并药液，过滤浓缩。水提液中加入1/4倍量的Sevag试剂，剧烈振摇30 min，3000 r/min离心10 min，弃下层有机相。上清液浓缩至50 mL，加入体积分数95%乙醇，边加边搅拌，至醇含量达80%，冷藏静置12 h后抽滤。将醇沉上清液部位以水溶解至0.5 g/mL，用0.1 mol/L的HCL调pH至4.2，抽滤，滤液上D101大孔吸附树脂柱，静置吸附12 h，然后依次用蒸馏水，10%、30%、50%的乙醇梯度洗脱，每个梯度洗脱4 BV，流速为4 BV/h，洗脱液浓缩干燥，得各梯度洗脱部位。

2.2 体外抗病毒活性部位的筛选

2.2.1 细胞复苏与传代

2.2.2 药物体外抗病毒实验

将样品用细胞维持液以2倍比做系列稀释(2-11～20)，共12个浓度，依次加入96孔板内的单层宿主细胞上(100 μL/孔)，并加100TCID50的病毒(100 μL/孔)，同时设病毒对照组、正常细胞对照组。于35 ℃、体积分数5% CO2中培养，待病毒对照组细胞病变效应(CPE)达90%时所有实验组终止培养。将96孔板里的细胞培养液拍出，加中性红染液(100 μL/孔)，35 ℃、5% CO2培养1 h后倒出染液，小水流冲洗3～5次后甩干，加脱色液(100 μL/孔)，37 ℃、5% CO2培养15 min，用酶标仪在540 nm处测定其吸光度值(OD值)，结合Reed-Muench 公式[7]：细胞比距=(高于50% 病变率-50%)/(高于50% 病变率-低于50% 病变率)×100%，计算治疗指数(TI)值(TI=TC50/EC50)，同时用电子显微镜观察。结果见表 1。

表1 败酱草各部位抗病毒筛选结果Table 1 Antiviral screening results of various parts of Patrinia Herb

2.3 抗病毒有效部位的LC-MS分析

2.3.1 测定条件

2.3.1.1 液相条件

色谱柱：Thermo Hypersil Gold C18柱(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)；流速：0.3 mL/min；柱温：45 ℃；进样温度：15 ℃；进样量5 μL；梯度洗脱，流动相A为水(含0.05%甲酸)，流动相B为乙腈，梯度洗脱：0～10 min，5%～23% B；10～12 min，23%～45% B；12～25 min，45%～46% B；25～28 min，46%～100% B。

2.3.1.2 质谱条件

采用负离子模式检测；采集范围100～1000m/z；分辨率70 000 HESI；离子源；毛细管温度300 ℃，电压3500 V；源内温度350 ℃；鞘气45，辅气10；S-Lens RF Level：55。

2.3.2 样品溶液的制备

精密称取30%乙醇洗脱部位20 mg，置25 mL容量瓶中，以80%甲醇溶解后定容，而后以0.22 μm微孔滤膜过滤，得样品溶液。

2.3.3 LC-MS分析

按2.3.2项下方法制备样品溶液，在2.3.1项下LC-MS条件进样分析，得到总离子流图(图1)，同时进行高分辨二级扫描，得到负离子模式下不同化合物的高分辨二级质谱信息(图2)。对图1提供的保留时间和图2提供的典型碎片离子峰进行分析，并通过与对照品对比鉴定，共鉴定出14个化合物(表2)。

图1 败酱草总黄酮部位的总离子流图Fig.1 Total ion current diagram of total flavonoids in Patrinia Herb

表2 败酱草总黄酮30%乙醇洗脱部位中14种成分鉴别分析结果Table 2 Results of the identification and analysis of 14 components of total flavonoids eluted by 30% ethanol of Patrinia Herb

2.3.3.1 化合物1

tR=4.02 min，m/z353.087 86 [M-H]-，根据m/z191.055 08，152.038 74等绿原酸典型碎片离子峰，经与对照品对比鉴定为绿原酸(图2)。

2.3.3.2 化合物2

tR=4.65 min，m/z179.033 97 [M-H]-，根据m/z135.043 75，112.984 06等咖啡酸的典型碎片离子峰，经与对照品对比鉴定为咖啡酸(图2)。

2.3.3.3 化合物3

tR=6.81 min，m/z563.140 99 [M-H]-，在二级质谱图中发现m/z545.132 93，503.121 55，473.109 25，443.098 42，383.077 45，353.067 05等碎片离子峰，m/z563.140 99脱水得到m/z545.132 93，m/z563.140 99糖链裂解丢失C2H4O2得到m/z503.121 55，m/z563.140 99糖链裂解丢失C3H6O3得到m/z473.109 25，m/z563.140 99糖链裂解丢失C4H8O4得到m/z443.098 42，m/z563.140 99糖链裂解连续丢失C2H4O2和C4H8O4得到m/z 383.077 45，m/z563.140 99糖链裂解连续丢失C3H6O3和C4H8O4得到m/z353.067 05，因此推测为夏佛塔苷(图2)。

2.3.3.4 化合物4

tR=8.03 min，m/z609.146 30 [M-H]-，另外二级质谱图中存在300.035 52，179.033 81，151.038 83等碎片离子峰，m/z300.999 18为苷元离子峰，m/z179.033 81、151.038 83为苷元离子发生逆-狄尔斯-阿尔德反应得到，经与对照品对比鉴定为芦丁(图2)。

2.3.3.5 化合物5

tR=8.53 min，m/z447.093 48 [M-H]-，另外二级质谱图中存在327.050 84，285.040 50，133.028 11等碎片离子峰，[M-H]-峰发生糖链裂解失去C4H8O4得到m/z327.050 84，m/z285.040 50为苷元离子峰，苷元离子发生逆-狄尔斯-阿尔德反应得到m/z133.028 11，因此推测为木犀草素-6-C-葡萄糖苷(图2)。

2.3.3.6 化合物6

tR=8.42 min，m/z447.093 51 [M-H]-，另外二级质谱图中存在285.040 50，257.044 49等碎片离子峰，其中m/z285.040 50为苷元离子峰，而后失去一分子CO得到m/z257.044 49，经与对照品对比鉴定为木犀草苷(图2)。

2.3.3.7 化合物7

tR=12.18 min，m/z285.040 47 [M-H]-，另外二级质谱图中存在257.044 65，151.002 32，133.027 98，107.012 25等典型碎片离子峰，其中m/z257.044 65由苷元离子失去一个H和CO得到，m/z151.002 32，133.027 98，107.012 25为苷元发生逆-狄尔斯-阿尔德反应产生，因此推测为木犀草素(图2)。

2.3.3.8 化合物8

tR=12.25 min，m/z301.035 46 [M-H]-，另外二级质谱图中存在273.040 71，178.997 53，151.002 35，107.012 25等典型碎片离子峰，m/z273.040 71为[M-H]-峰失去CO得到，m/z178.997 53，151.002 35，107.012 25为苷元发生逆-狄尔斯-阿尔德反应产生，经与对照品对比鉴定为槲皮素(图2)。

2.3.3.9 化合物9

tR=12.83 min，m/z269.045 53 [M-H]-，二级质谱图中发现227.034 01，225.055 13，201.054 93，183.044 04，151.002 40，117.033 01，107.012 27等碎片离子峰，[M-H]-峰发生C环裂解生成m/z151.002 40，117.033 01，107.012 27，m/z227.034 01，225.055 13，201.054 93分别由[M-H]-峰失去一分子C2H2O，CO2以及C3O2得到，[M-H]-峰连续失去C2H2O和CO2得到m/z183.044 04，因此推测为芹菜素(图2)。

2.3.3.10 化合物10

tR=12.97 min，m/z285.040 68 [M-H]-，二级质谱图中发现267.160 37，255.160 31，227.128 27，211.133 36，133.012 91等碎片离子峰，[M-H]-峰发生C环裂解生成m/z133.012 91，m/z267.160 37，255.160 31分别由m/z285.040 68失去一分子H2O和OCH2得到，m/z255.160 31失去CO得到m/z227.128 27，m/z255.160 31失去CO2得到m/z211.133 36，经与对照品对比鉴定为山奈酚(图2)。

2.3.3.11 化合物11

tR=13.05 min，m/z315.050 93 [M-H]-，另外二级质谱图中存在300.027 50，283.025 27，271.024 78，255.029 74，227.034 38，216.042 53，164.010 21，151.002 40，148.015 29，107.012 23等碎片离子峰，[M-H]-峰失去一分子CH3得到m/z300.027 50，m/z300.027 50失去一分子COH得到m/z271.024 78，m/z300.02750失去一分子CO2H得到m/z255.029 74，m/z255.029 74失去一分子CO得到m/z227.034 38，m/z300.027 50发生C环裂解生成m/z164.010 21，151.002 40，148.015 29，107.012 23，因此推测为异鼠李素(图2)。

2.3.3.12 化合物12

tR=13.35 min，m/z255.102 49 [M-H]-，另外二级质谱图中存在135.043 72，118.997 07等碎片离子峰，为发生逆-狄尔斯-阿尔德反应产生的甘草素的典型碎片离子峰，因此推测为甘草素(图2)。

2.3.3.13 化合物13

tR=14.76 min，m/z299.056 12 [M-H]-，另外二级质谱图中存在284.032 65，256.031 45，227.034 23，151.002 41，107.012 28等碎片离子峰，[M-H]-峰失去一分子CH3得到m/z284.032 65，m/z284.032 65失去一分子CO得到m/z256.031 45，m/z256.031 45失去一分子COH得到m/z227.034 23，m/z284.032 65发生C环裂解生成m/z151.002 41，107.012 28，因此推测为香叶木素(图2)。

2.3.3.14 化合物14

tR=14.89 min，m/z299.056 15[M-H]-，另外二级质谱图中存在m/z599.107 06，这是[2M-H]-的信号峰，经与对照品对比鉴定为山奈素(图2)。

图2 化合物1～14的二级质谱图Fig.2 Secondary mass spectrum of compound 1～14

续图2

3 讨论

本研究选择了EV-71，HSV-1，RSV三种病毒株来检测败酱草总黄酮部位抗病毒活性。其中EV-71感染会导致手足口病、脑炎、脑膜炎、口腔炎、咽炎、出疹性疾病、肌病等，严重者可造成死亡，已经成为我国儿童常见的感染疾病，但目前尚无有效治疗EV71感染的药物上市[8]；HSV-1感染能引起口腔及生殖器黏膜产生疱疹和溃疡，严重者可引发脑炎[9]；RSV是婴幼儿、老年人和免疫功能低下者诱发下呼吸道感染的主要原因[10]。另外这三种病毒的发病症状均为温病症状，温病多为急性外感疾病，发病急，变化快，变证多，研究温病对病毒研究有十分重要的作用[11]。

本研究结果显示败酱草总黄酮30%乙醇洗脱部位对EV-71以及HSV-1病毒都具有显著的抑制作用，对其活性成分进行LC-MS定性分析鉴定出14个化合物，即为绿原酸、咖啡酸、夏佛塔苷、芦丁、木犀草素-6-C-葡萄糖苷、木犀草苷、木犀草素、槲皮素、芹菜素、山奈酚、异鼠李素、甘草素、香叶木素、山奈素，这些活性成分的进一步抗病毒活性评价有待后续研究。